小麦锰超氧化物歧化酶基因的克隆与原核表达

于永昂， 张 蕾， 赵俊杰， 贺 杰， 马振锋， 胡海燕

(河南科技学院生命科技学院/现代生物育种河南省协同创新中心，河南新乡 453003)

植物在自然界中经常会受到病菌、干旱、冷害和高盐等生物和非生物胁迫，引发细胞内部产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，大量积累的ROS能够对植物体内的核酸、脂质、蛋白质等生物大分子产生伤害[1]。为了保持细胞内部氧化还原的平衡，植物在长期进化过程中发展出几种酶和非酶系统来缓解由活性氧引起的氧化损伤，其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是植物用来清除活性氧的一种关键酶。SOD能够催化植物体内分子氧活化的中间产物超氧阴离子自由基(O2-·)的歧化反应从而生成氧分子和过氧化氢，在逆境胁迫下增强SOD基因表达能够提高植物清除活性氧的能力，增强植物的抗逆性[2]。超氧化物歧化酶按照金属辅基主要分为铁(Fe)SOD、(锰)SOD和(铜/锌)SOD 3种。许多研究表明，MnSOD与作物的抗逆性有着密切的关系。Tanaka等利用酵母MnSOD在水稻中过量表达提高了转基因植株对盐胁迫的耐受性，转基因植株的SOD和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性在盐胁迫处理条件下能够提高1.5～2.0倍[3]；韩利芳等将烟草MnSOD基因转入苜蓿中提高了转基因植株的MnSOD活性[4]；王丙锋等将柽柳MnSOD基因转化到酵母基因组中，提高了酵母的抗旱和耐高温的能力[5]；陈莉等在仙客来中过表达MnSOD基因，提高了转基因植物对高温胁迫的抗性[6]。

小麦是我国重要的粮食作物之一，但干旱、低温和盐碱等非生物胁迫严重影响其产量[7]。为此，本研究从小麦叶片中克隆MnSOD基因全长序列，并对该基因蛋白在生物信息学分析的基础上构建了pET32-TaMnSOD原核表达载体，在大肠杆菌中用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)成功诱导表达出目的蛋白，为小麦MnSOD蛋白的进一步分离纯化和基因的表达、提高小麦对逆境胁迫的适应能力奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 本试验小麦品种为矮抗58，由河南科技学院小麦中心提供。2016年5月选取颗粒饱满、大小一致的种子用0.1% HgCl2消毒10 min后，用流水冲洗5次后置于铺有滤纸的培养皿中发芽，3 d后选取发芽的小麦种子播种至含有混合营养基质的营养钵内，在16 h光照(28 ℃)—8 h黑暗(25 ℃)培养箱中培养，3叶期时，取新鲜嫩叶用液氮速冻后，-80 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 菌株与试剂 原核表达载体pET-32a、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α及表达菌株BL21(DE3)均由河南科技学院生命科技学院分子生物学实验室保存。pGM-T载体、DNA凝胶回收试剂盒、TaqDNA聚合酶及质粒小量抽提试剂盒均购自TIANGEN公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 小麦叶片总RNA的提取和cDNA的合成 参照Trizol试剂盒说明书提取小麦叶片的总RNA。调整提取的RNA浓度为200 ng/μL，用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa，大连)按操作说明合成cDNA第1链。

1.2.2 小麦MnSOD基因的克隆 根据GenBank公布的小麦MnSOD基因序列(GenBank登录号：AF092524)设计特异性引物MnSOD-F1(5′-CCATGGCGCTCCGCACGTT-3′)和MnSOD-R1(5′-GTGTCACCTCTATGCAATGT-3′)。以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化PCR产物。将回收的目的片段与pGM-T载体连接后转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行PCR鉴定后送北京三博远志生物技术有限公司进行测序。

1.2.3 小麦MnSOD基因的生物信息学分析 用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析小麦MnSOD编码氨基酸序列的物理性质；用Predict protein预测MnSOD基因编码蛋白的二级结构；用SMATER分析MnSOD基因编码蛋白的氨基酸序列的保守结构域；利用BlastP(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行同源性搜索，选取与小麦MnSOD同源性较高的植物的MnSOD氨基酸序列，利用DNAMAN 8.0进行多序列比对，用Mega 5.0软件构建系统发育树。

1.2.4 原核表达载体的构建 根据获得的小麦MnSOD编码区序列设计原核表达引物MnSOD-F2(5′-CGGGATCCATGGCGCTCCGCACGTTG-3′，下划线部分为BamHⅠ酶切位点)和MnSOD-R2(5′-CCCAAGCTTCGCAAGCACTTTTTC ATA-3′，下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点)，以小麦叶片cDNA为模板进行PCR扩增。用T4连接酶将回收纯化的PCR产物与pGM-T载体于16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取单克隆进行测序分析。将测序正确的pGM-TaMnSOD质粒与原核表达载体pET-32a分别用BamHⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切操作，回收目的片段，经T4连接酶连接后，转化DH5α感受态细胞，抽提质粒经PCR和双酶切鉴定，获得原核表达载体pET32a-TaMnSOD。

1.2.5 重组质粒融合蛋白的表达 将测序正确的pET32a-TaMnSOD重组质粒热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上。挑取阳性克隆于含有卡那霉素的5 mL LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养12 h。按1%的接种量接种到10 mL LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养至D600 nm为0.5左右，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导3 h。5 000 r/min离心5 min收集菌体，加入SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)上样缓冲液煮沸10 min，取10 μL进行SDS-PAGE(5%浓缩胶，12%分离胶)，分析蛋白表达结果。

2 结果与分析

2.1 小麦MnSOD基因的克隆

以小麦叶片cDNA为模板进行逆转录PCR(RT-PCR)，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在分子量相当于750 bp左右扩增出1条清晰的条带(图1)，与预测大小相符，推断其为小麦MnSOD基因序列。测序结果表明，该基因全长813 bp。采用NCBI(美国国立生物技术信息中心)的ORF Finder分析发现，该序列包含1个675 bp的开放阅读框，编码224个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA(图2)。

2.2 小麦MnSOD基因的生物信息学分析

用ProtParam预测TaMnSOD基因编码蛋白的相对分子量为24.56 ku，分子式为C1 119H1 724N300O318S3，等电点(pI)为6.83。理论推导其半衰期约为30 h，不稳定参数为29.56，蛋白质性质稳定(不稳定参数在40以下为稳定蛋白)。总的带负电荷的残基(Asp+Glu，即天冬氨酸+谷氨酸)为24个，总的带正电荷的残基(Arg+Lys，即精氨酸+赖氨酸)为23个。亲水性平均数为-0.269，预测该蛋白为亲水性蛋白，其脂肪指数为91.52。用TMHMM-2.0(http：//www. cbs. dtu. dk / services / TMHMM-2.0)对TaMnSOD的氨基酸序列进行分析，没有跨膜结构域，没有信号肽，是一个可溶性蛋白质。MnSOD蛋白二级结构预测结果显示，在整个蛋白中，α-螺旋占35.71%，β-折叠占15.18%，无规则卷曲占27.23%，延伸链占 21.88%。将推测的TaMnSOD氨基酸序列在GenBank上进行Blast比对后，采用DNAMAN 6.0软件进行多重序列比对。将克隆的TaMnSOD基因编码的氨基酸序列与GenBank中其他植物的MnSOD氨基酸序列进行比对，发现该基因编码蛋白与大麦(BAK03227)、二穗短柄草(XP_010231530)、水稻(XP_015640127)的MnSOD具有较高的同源性，氨基酸相似性分别达到95.13%、88.70%、82.68%(图3)。进一步经Clustal W聚类分析后，利用Mega 5.0软件采用相邻连接法绘制进化树，结果表明，本研究克隆的小麦TaMnSOD基因编码的蛋白和大麦的亲缘关系最近(图4)。

2.3 原核表达载体的构建与鉴定

使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切质粒pET32-TaMnSOD，切出来的片段与预期结果大小一致，表明TaMnSOD基因已经插入载体pET-32a中(图5)。酶切鉴定正确的阳性克隆，经测序后显示插入的外源基因序列与预期片段序列一致，未出现碱基突变及移码现象。由此表明，pET32-TaMnSOD原核表达载体构建成功。

2.4 MnSOD基因重组蛋白的SDS-PAGE分析

将构建成功的重组表达质粒pET32-TaMnSOD转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在37℃、IPTG浓度为0.5 mmol/L 条件下，分别诱导1、2、3、4 h后进行SDS-PAGE分析。图6结果表明，与对照相比，pET32-TaMnSOD转化菌经IPTG诱导后，在相对分子质量为45 ku左右处有1条蛋白条带，除去载体PET32自身表达的20 ku蛋白后，结果与预期的目的蛋白(24.56 ku)大小一致。

3 讨论

植物在不利环境胁迫(盐渍、干旱、高温、低温等)下其细胞代谢过程不协调会引起ROS大量积累，构成氧化胁迫威胁植物的细胞结构[8-9]。因此，采用分子生物学手段，对植物的氧化代谢进行修饰，提高植物抗氧化胁迫的能力，是植物抗性研究的方向之一[10-11]。SOD是植物细胞防御系统中重要的保护酶类，在防御活性氧伤害中起着关键性的作用，其活性高低与植物的抗逆能力密切相关[12]。目前，植物中许多MnSOD基因已经被克隆并用来转化不同植物，获得了SOD活性增强的转基因植株。邓婷婷等将极端耐盐的盐生杜氏藻的DsMnSOD基因转化SOD缺陷型大肠杆菌并诱导其表达，结果表明，转染后的大肠杆菌在耐盐和抗寒等方面的耐受性明显提高[13]。付畅等将西伯利亚蓼PsMnSOD基因转入酵母中，提高了酵母在盐碱胁迫下的SOD活性，并提高了酵母对盐碱胁迫的抗性，表明PsMnSOD基因在抵御盐碱胁迫中起到非常重要的作用[14]。另外，MnSOD在转基因烟草、苜蓿和棉花等植物中的过量表达提高了它们对氧化胁迫的耐受性[10]。由此表明，MnSOD基因对于增强植物的抗逆能力具有重要作用。

目前，用于表达重组蛋白的外源系统主要有大肠杆菌系统、酵母表达系统和动物细胞表达系统[15-17]。大肠杆菌表达系统因其具有遗传背景清楚、结构简单、外源蛋白表达量高以及基因表达调控机制明确等优点，已经成为目前最常用的表达宿主[18]。真核生物基因的原核表达受表达载体、宿主菌、IPTG浓度、温度、诱导表达时间等因素的影响[19-20]。本试验采用目前应用最广泛的pET大肠杆菌表达系统进行原核表达，该系统能与Tag(标签)连接进行融合蛋白表达，目的蛋白易于纯化，并且具有操作方便、表达量大等优点[21]。一般 37 ℃、0.5 mmol/L 终浓度的IPTG适合绝大多数的蛋白表达，本研究采用该条件进行原核表达，所表达出的融合蛋白与目的蛋白相对分子量一致。

本研究从小麦叶片中克隆到Mn超氧化物歧化酶基因TaMnSOD，其编码蛋白与其他植物中的MnSOD具有较高的相似性。将TaMnSOD基因与原核表达载体PET-32a构建融合表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，从而为小麦MnSOD基因编码蛋白功能研究提供理论基础。