延安产2种蒿类挥发油提取及抑菌活性分析

艾飞翔，周靖怡，马 秋 ，张恩生，陈小莉，胡华林，李 䶮，杨 华

（1.延安大学化学与化工学院，陕西 延安 716000；2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室/贵州医科大学天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 510014）

植物源杀菌剂具有高效、低毒、无毒、易降解、选择性高、不产生抗药性等优点，近年来作为“环境和谐农药”受到人们的广泛关注［1］。其中，植物挥发油杀菌剂占有重要比例［2-6］。青蒿（Artemisia carvifolia）和白蒿（Herba artimisiae sieversianae）均属菊科（Compositae）蒿属（Artemisia）植物，为传统中药，已有研究报道了不同产地白蒿和青蒿的挥发油成分及抑菌活性。采用水蒸气蒸馏法提取不同产地、不同季节的青蒿（A. carvifolia）挥发油，结果表明不同产地和不同季节的青蒿挥发油的主要成分及含量各不相同［7-11］；采用纸片法测定青蒿挥发油的抑菌活性，结果表明青蒿挥发油对大肠杆菌和茄链格孢菌具有显著的抑制作用［11］；采用水蒸气蒸馏法提取不同地方、不同季节的白蒿挥发油，结果表明，在白蒿挥发油中脂类、醇类、烷烃类化合物、萜烯类含量较多［12-16］；Zhimin等［13］发现白蒿挥发油对玉米象鼻虫有熏蒸活性和接触毒性，其 LC50和 LD50值分别为15.0、112.7 mg/L；吕敏兰［16］报道了白蒿挥发油的抑菌效果会随着生长期的不同而变化。

由此可见，不同产地、不同季节植物的化学成分及含量不同，导致植物提取物生物活性的改变。延安位于陕西省北部，属黄土高原丘陵沟壑区，平均海拔1 200 m左右，属于暖温带半湿润易旱气候区，特殊的地理气候造就了延安产植物化学成分及活性有别于其他地方产的植物。鉴于延安产青蒿和白蒿从未被报道过，本研究拟通过水蒸气蒸馏法提取其挥发油，分析其化学成分，并对挥发油进行抑菌活性测试，以期为该类植物累积实验数据，为其应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物：青蒿和白蒿，于7月份采摘于延安境内。

供试真菌：腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、人参锈腐菌（Cylindrocarpon destructans）、菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum）、油菜菌核（Sclerotinia sclerotioru）、立枯丝菌核（Rhizoctonia solani）、梨黑星病（Venturia nashicola）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata）、 根 腐 菌（Fusarium solani）、苍术黑斑病菌（Alternaria tenuissima）菌种，均由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室提供，4℃冷藏保存。

供试细菌：绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、青枯菌（Ralstonia solanacearum），均由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室提供，4℃冷藏保存。

试剂：蒸馏水（实验室自制）、乙醚（分析纯）、无水硫酸钠（分析纯）。

仪器：N-1100型旋转蒸发仪，水蒸气蒸馏装置、中草药粉碎机、日本岛津QP2010型气相色谱-质谱联用仪。

1.2 试验方法

1.2.1 挥发油的提取 将采集的青蒿和白蒿植物样品阴干，粉碎，过孔径900 μm筛，称量500 g，置1 000 mL圆底烧瓶中，加水500～900 mL，浸泡12 h，连接好水蒸气蒸馏装置。用电热套缓缓加热圆底烧瓶至沸腾，并一直保持微沸状态约5 h，直至无油状物流出为止。用等体积的乙醚萃取馏出液3次，合并乙醚层，用无水硫酸钠进行干燥，过滤掉无水硫酸钠，用旋转蒸发仪去除乙醚，得到挥发油，密封4℃保存备用。

1.2.2 GC-MS法确定挥发油成分 气相色谱条件：色谱柱为弹性石英毛细管柱（ZB-5MSI，30 m × 0.25 μm × 250 μm）。用正己烷配制成150 mg/mL的2种植物精油溶液。程序升温：初始温度46℃保持 2 min，以4℃/min 升至206℃，再以 8℃/min升至310℃保持 3 min，然后青蒿和白蒿精油在310℃条件下分别运行 44 min和46 min。柱子参数：汽化室温度 250℃，接口温度 280℃，进样量 1 μL，载气为 99.999%高纯氦气，柱前压 0.0528 MPa（7.65 psi），载气流量 1.0 mL/min，分流比 20∶1，溶剂滞后时间 4.0 min。

质谱条件：电子能量70 eV，离子源为 EI源，EI 源温度230℃，发射电流 34.6 μA，四极杆温度 150℃，倍增器电压1 482V，质量范围 29～500 amu。

青蒿、白蒿挥发油用气相色谱-质谱-计算机联用仪进行分析鉴定，各峰经质谱计算机数据系统检索，标准图谱库Nist 2005和Wiley 275，确定挥发油的化合物结构，用峰面积归一化法确定各化学成分的相对含量。

1.2.3 抑制真菌活性测定 将供试样品用DMSO溶解，在无菌条件下用PDA培养基稀释至2.0 mg/mL，使DMSO含量不超过5%，以1.1所示供试真菌为测试菌，利用抑制菌丝生长速率法［17］测试供试样品抑制真菌的活性，以等量DMSO为对照，3次重复。放置于25℃培养箱中培养，72 h后用十字交叉法测定供试菌菌落生长直径，计算菌丝生长抑制率：

1.2.4 抑制细菌活性测定 采用96孔板微量稀释法［18］：将2种精油用5%DMSO配成2.0 mg/mL的溶液，以含有1.1所示供试细菌的BPB培养基进行2倍稀释，以无菌培养液和5%DMSO溶液为空白对照，3次重复。微孔板震荡混合后，置于37℃培养箱内培养18 h后观察结果，肉汤无浑浊的孔中的最低药液质量浓度为样品对供试细菌的最低抑菌质量浓度（MIC）。

2 结果与分析

2.1 青蒿和白蒿挥发油的抑制真菌活性分析

检测了青蒿和白蒿精油对9种植物病原真菌的抑菌活性，结果（表1）表明，青蒿对所测植物病原真菌有一定的抑制作用，但抑制作用均较弱，对梨黑星病菌的抑制作用最强，也仅为68.00%。白蒿对真菌的抑制作用均较强，对供试的9种真菌的抑制率均达到65%以上，对梨黑星病作用最强、为98.11%，对人参锈腐菌、烟草赤星病菌的抑制率均达到90%以上，对立枯丝核菌抑制作用最差，也达到65.62%。

表1 青蒿和白蒿挥发油抑制真菌活性结果

2.2 青蒿和白蒿挥发油的抑制细菌活性分析

本研究检测了青蒿和白蒿精油对5种供试细菌的抑菌活性，结果表明，两种精油对绿脓杆菌（P. aeruginosa）、金黄葡萄球菌（S.aureus）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、青枯菌（R.solanacearum）均没有抑制作用，对大肠杆菌（E.coli）有一定的抑制作用，MIC均为500 mg/mL。

2.3 青蒿和白蒿挥发油化学成分的GC-MS分析

青蒿挥发油总离子流图谱见图1，主要化学成分见表2。由表2可知，从延安产青蒿挥发油中共鉴定出26种化合物，其含量占总含量的67.95%，其中含量最高的为石竹烯氧化物（25.75%），其次为β-蛇床烯（8.31%），斯巴醇和1,1,6,6-四甲基二螺［2.1.2.1］辛烷含量分别为6.06%和6.01%，这几种物质的总量接近50%，是青蒿挥发油的主要化学成分。

白蒿挥发油总离子流图谱见图2，主要化学成分见表3。由表3可知，从延安产白蒿挥发油中共鉴定出49种化合物，占总含量的82.51%，其中含量最高的是萘嵌戊烷（30.37%），其次为匙叶桉油烯醇（12.04%），戊酸戊酯的含量为10.89%，茵陈炔酮的含量也达到7.88%，这几种成分的总含量超过了60%，是白蒿挥发油的主要化学成分。

3 结论与讨论

图1 青蒿挥发油总流离子图谱

图2 白蒿挥发油总流离子图谱

表2 青蒿挥发油主要化学成分

本研究分析了延安产青蒿和白蒿的挥发油化学成分及抑菌活性，结果表明延安产青蒿成分类型较其他地区略显简单，含量最多的成分为石竹烯氧化物（25.75%），β-蛇床烯（8.31%）、斯巴醇（6.06%）、1，1，6，6-四甲基二螺［2.1.2.1］辛烷（6.01%），与重庆等地产青蒿的主要化学成分有所不同［7-8，10，19］。其他地区产青蒿挥发油中蒿酮、桉叶素、樟脑、β-愈创木烯、1，3-二氧杂环戊烷、2-己烯醛、2，4-二甲基-2-戊烯等含量较多，而在延安产青蒿中的含量较少或没有检测出。刘芳［20］报道了采自辽宁白城的青蒿的挥发油对几种植物病原真菌的抑制作用较为明显。但本研究测试的延安产青蒿挥发油对9种供试植物病原真菌的抑制率不高，均在70%以下，可能是延安产青蒿挥发油中含有的抑菌活性成分较少。

表3 白蒿挥发油主要化学成分

延安产白蒿挥发油所含成分类型较其他地区复杂，主要成分为萘嵌戊烷（30.37%）、戊酸戊酯（10.89%）、匙叶桉油烯醇（12.04%）、茵陈炔酮（7.88%）。文献［12-15，21-22］报道在哈萨克斯坦、哈尔滨、兰州等地区所鉴定的白蒿挥发油中含量较多的为桉叶油素、丁酸香叶酯、龙脑、樟脑、月桂烯、1，8-桉叶醚、芳樟醇、2-乙烯基萘、亚油酸、棕榈酸、巴豆酸乙烯酯等，而这些物质在延安产白蒿挥发油中含量较少或者没有检测出。生物活性检测表明，白蒿挥发油对9种供试真菌的抑制率较高，均在65%以上，其中对人参锈腐菌（C.destructans）、梨黑星病（V. nashicola）、烟草赤星病菌（A. alternata）的抑制率较高，达到90%以上，然而对于细菌的抑制活性较低，对大肠杆菌（E. coli）的MIC值为500 mg/mL。结果表明，白蒿挥发油对于植物病原真菌有较强的抑制作用，具有开发为农用植物源抑菌剂的潜力。

综上所述，延安产青蒿和白蒿挥发油与产自其他地区青蒿和白蒿的挥发油化学成分和活性均有所不同，这可能受延安特殊的地理地貌、年降雨量、土壤pH、阳光照射时间、空气湿度等因素的影响，导致了延安产植物的化学成分及其含量与其他地方不同，不同的物质基础导致其活性也不同［23］。中草药自古是陕北的三大宝之一，陕北的地理地貌和自然条件影响着某些植物次生代谢产物的累积，因此对陕北产药用植物活性成分及活性的研究为陕北发展中药材种植及开发利用具有重要意义。