MicroRNAs在糖尿病肾病中的研究进展*

熊思，彭辉勇，柳迎昭

（江苏大学附属人民医院 1.内分泌科，2.检验科，江苏 镇江 212002）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最常见的微血管并发症，也是导致糖尿病患者死亡的主要慢性并发症。临床表现为蛋白尿、水肿、高血压以及肾功能渐进性损害等。DN已成为终末期肾病（end stage renal disease, ESRD）的最主要病因之一，而由DN引起的ESRD的发病也呈逐年递增的趋势。目前对其仍无针对性的治疗方法，临床DN患者往往预后欠佳[1-2]。因此，寻找有助于早期诊断的生物标记物及有效的治疗靶点十分重要。

DN的发病机制至今仍未完全明确，近年来有研究表明许多微RNAs（microRNAs, miRNAs）在DN患者中表达异常并参与系膜细胞外基质（extracellular matrix, ECM）聚集及足细胞损伤等DN的病理过程[3-4]。因此以miRNAs为切入点进行研究，或许能为临床DN的诊治提供一些新的思路和方向。本文就近年来新发现的参与DN发生、发展的microRNAs及相关作用机制进行综述。

1 miRNAs简介

miRNAs是一类由内源基因编码的长度约为19～25个核苷酸的非编码单链RNA分子，广泛分布于真核生物及病毒等体内。每个miRNAs可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一基因。miRNA与RNA诱导的基因沉默复合物（RNA induced gene silencing complex,RISC）结合形成RISC复合体后被激活。miRNA-RISC对靶基因的作用方式有3种：①与靶基因完全互补结合后直接切割靶mRNA；②与靶基因不完全互补结合进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性；③兼具以上两种作用模式：当与靶基因互补结合时，直接靶向切割mRNA；当与靶基因不完全结合时，起调节基因表达的作用。迄今已有2 000多种成熟miRNAs被识别，且miRNAs被发现可以调节至少60%的人类蛋白编码基因。miRNAs被发现参与早期发育，细胞增殖，细胞分化，细胞凋亡等多种生物学过程[5]。

2 糖尿病肾病的发病机制

DN是由于糖尿病糖代谢异常为主因所致的肾小球硬化及尿蛋白含量异常等变化的慢性疾病。其发病机制主要包括血流动力学异常、糖脂代谢异常、遗传因素及各种细胞因子的作用等。其病理变化主要可表现为高糖状态下肾小球系膜区细胞（glomerular mesangial cell, GMC）异常增生，导致大量ECM成分如胶原蛋白、纤维连接蛋白合成和分解代谢失衡以致其过度堆积，最终引起肾小球系膜区扩张、肾小球硬化、肾小管间质纤维化等[1-2]。

3 miRNAs与糖尿病肾病的发病机制

各种体内外实验证实，miRNAs可通过不同的作用机制参与DN的各种病理变化过程。现将高糖状态下在不同细胞或组织中异常表达的miRNAs及其相关作用机制分述如下。

3.1 miRNAs与糖尿病肾病的血流动力学变化

高糖状态下肾小球内血管压力增高引起肾小球滤过率（glomerular filtration rate, GFR）增加，导致系膜基质增加及肾小球基底膜（glomerular basement membrane, GBM）增厚，从而引起肾小球局灶性硬化。同时血管通透性增加，导致肾小球分子滤过屏障被破坏，大分子物质如白蛋白等被滤过形成蛋白尿[1-2]。

miRNA-124在哺乳动物中枢神经系统中表达量最高，在胰岛B细胞中也大量存在，其下游靶标可参与调控胰岛素的分泌[6]。Rho蛋白是一种小G蛋白，Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated coiledcoil containing protein kinase, ROCK）是小G蛋白下游的效应器。其通过使肌球蛋白轻链磷酸化和肌球蛋白轻链磷酸酶的肌球蛋白结合亚基磷酸化，导致平滑肌收缩。ROCK是Rho的作用靶标，Rho/ROCK信号通路可以通过对血管平滑肌细胞的作用介导血管紧张度的改变，调节血管阻力，使血管内皮细胞的通透性增加，大分子物质如白蛋白等也被滤过由尿液排出形成蛋白尿。高糖环境下Rho/ROCK信号通路被激活，调节入球动脉和出球动脉的收缩功能，从而改变DN过程中的血流动力学，导致肾小球滤过率增加，蛋白尿等增多[7]。ROCK分为ROCK1和ROCK2两种同源异构体。刘宇等[8]研究发现ROCK1是miRNA-124的直接靶标，在肾脏高表达。miRNA-124可负性调控ROCK1的蛋白表达。因此，miRNA-124可通过抑制ROCK1的表达来延缓DN的进展。

3.2 miRNAs与糖尿病肾病细胞周期变化

细胞周期素（cell division cyclin, CDC）对于细胞周期有正性调节作用，而细胞周期素依赖性激酶（cyclin-dependent kinase, CDK）又是CDC的主要调节物质。当细胞周期素的合成被干扰时，可导致细胞周期停滞在以蛋白质合成为主的G1期，引起GMCs体积增大，导致系膜区扩张及ECM聚集等病理变化[9]。

K.LLING等[9]研究发现，和健康人相比，DN患者血清miRNA-21浓度明显升高，且尿液miRNA-21被发现与蛋白尿密切相关，而且在DN患者肾组织活检中发现miRNA-21与肾小管间质纤维化呈正相关。抑制miRNA-21的表达能减弱糖尿病小鼠中的GMCs增生，间质纤维化，巨噬细胞浸润，足细胞缺失，蛋白尿以及纤维化和炎症基因的表达。实验发现CDC25a和CDK6是GMCs中miRNA-21的靶标[9]。CDK6对于细胞周期进程和G1/S期的过渡十分重要，干扰CDC25a和CDK6的表达可以导致细胞周期停滞在G1期。当细胞停滞在G1/S期的过渡阶段时，由于蛋白质/DNA合成比的增加导致细胞体积增大，进而引起GMCs肥大增生，导致肾小球系膜区扩张，促进DN的病理化进程[9]。miRNA-21对CDC25a和CDK6表达的抑制导致细胞周期进程的损伤以及随之发生的GMCs过度增生。因此，miRNA-21表达沉默或许能成为抑制糖尿病长期或短期并发症的有效的治疗途径。

3.3 miRNAs与糖尿病肾病的炎症及免疫反应

炎症反应以及免疫应答在DN的发生、发展中也扮演着重要角色。促炎因子如肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α, TNF-α）、单核细胞趋化蛋白（monocyte chemotactic protein-1, MCP-1）等及免疫细胞Th1、Th17等细胞均与DN发病相关[10-11]。

CHEN等[10]发现糖尿病小鼠过表达miRNA-29b能减弱肾脏组织纤维化及炎症反应，而敲除表达miRNA-29b的基因则增强上述反应。NF-κB信号通路可参与免疫反应、细胞凋亡等多种生物学进程。作为参与DN的主要信号通路之一，核转录因子kappa B（nuclear factor kappa B, NF-κB）信号通路活化可引起促炎因子如TNF-α、MCP-1表达上调以及巨噬细胞浸润[11]。sp1是激活NF-kB信号通路的关键转录因子，而miRNA-29b可通过抑制sp1来抑制sp1/NF-kB信号通路，进而抑制促炎因子的释放，延缓DN的进展。DN小鼠中Th1及Th17细胞比例增加而调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）比例减少，说明T细胞参与了其中的免疫应答反应[10]。T-bet是Th1细胞特异性的转录因子，能促进Th1细胞特征性细胞因子干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）的产生。因此，miRNA-29b通过抑制T-bet的表达从而抑制IFN-γ的产生，抑制DN小鼠中肾脏的免疫应答，从而阻止或延缓DN的发生。

BHATT等[12]发现在DN状态下的巨噬细胞及肾脏细胞中，已知的抗炎因子miRNA-146a表达上调。而miRNA-146a的靶分子肿瘤坏死因子受体相关因子 6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6）和白细胞介素1受体相关激酶1（interleukin-1 receptor associated kinase 1, IRAK1）可引起NF-kB信号通路的活化，激活炎症反应。高糖状态下miRNA-146a的表达上调可直接抑制其靶基因TRAF6和IRAK1的表达从而抑制DN中的炎症反应[11-12]。因此，miRNA-146a可通过作用于其靶基因抑制炎症反应，从而在DN早期对机体产生保护作用。

3.4 miRNAs与糖尿病肾病的氧化应激

氧化应激（oxidative stress, OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，导致炎症细胞浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。高糖状态下氧化和抗氧化的平衡被打破，产生的活性氧（reactive oxygen species, ROS）引起足细胞损伤，并破坏GBM的机械屏障及电荷屏障，并且通过各种信号通路导致ECM合成增多，促进DN发生[13-14]。

ALVAREZ等[14]研究发现miRNA-1207-5p在肾脏细胞中大量表达，且在高糖状态下表达增加。miRNA1207-5p直接抑制其靶基因6磷酸葡萄糖脱氢酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase, G6PD）的表达，G6PD是产生还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）的磷酸戊糖途径的限速酶，因此NADPH的表达也随之减少，导致活性氧（ROS）产量增多。大量的ROS可诱导多种细胞因子表达增加，使肾小球滤过增加，GBM增厚，促进DN的发病并参与病情发展[13-14]。

3.5 miRNAs与糖尿病肾病的上皮-间充质转分化

上皮-间充质转分化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）在肾小管间质纤维化过程中扮演重要角色。上皮细胞转化为间充质细胞如纤维细胞、成纤维细胞等后，其迁移能力及侵袭能力均增强，同时产生更多的ECM，从而加重DN中ECM的堆积，加剧DN中的病理变化[15]。

ZHAO等[16]发现在DN小鼠中miRNA-30c通过抑制snail1-TGF-β1信号通路抑制EMT从而延缓DN的进展。暴露于高糖环境下的肾小管间质细胞中的miRNA-30c的减少导致转录因子snail1病理状态的激活，随后促进肾小管细胞中EMT的发生。肾脏纤维化中转化生长因子（transforming growth factor β1,TGF-β1）的表达和活化均依赖于snail1的活化。高糖诱导snail1激活TGF-β1的表达，且高糖状态增加TGF-β1的分泌。该实验确定肾小管细胞中EMT的miRNA-30c-snail1-TGF-β抑制轴线。这条轴线可以调节纤维细胞的活化以及肾小管间质肌成纤维细胞的纤维增生过程，最终阻止或延缓DN进程中的肾小管间质纤维化过程[16-17]。

3.6 miRNAs与糖尿病肾病的细胞因子

各种细胞因子如纤溶酶原激活物抑制物1（plasminogen activator inhibitor type 1, PAI-1）、TGF-β、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）等相互联系，相互影响，共同参与DN的病理变化过程。

3.6.1 miRNAs与PAI-1 ECM的过度堆积引起肾小球硬化，而纤溶酶是降解ECM的主要酶类之一，PAI-1通过抑制纤溶酶原激活物而抑制纤溶酶活性，使ECM降解减少[18-19]。

TGF-β可上调多种细胞PAI-1的表达[18]。研究表明，高糖可激活GMCs中TGF-β/Smad3信号转导通路，促进PAI-1表达，从而抑制ECM降解。过氧化物酶体增殖体激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPARγ）是核受体超家族中的重要一员，对调节GMC增殖有重要作用。PPARγ表达增加能够抑制高糖诱导的GMC中TGF-β1的表达，也减少PAI-1表达，从而减少ECM的聚集[19]。WU等[20]研究发现miRNA-27a在DN患者的血清中表达增加。miRNA-27a可通过抑制其靶基因PPARγ的表达促进PAI-1的表达，抑制ECM的降解并增加其聚集，从而对DN的进展产生影响。

用血管紧张素转换酶抑制剂减少蛋白尿可减轻肥胖糖尿病小鼠中的肾脏纤维化。而这种变化被发现与miRNA-184/LPP3调节相关[21]。磷酸酯磷酸酶3（lipid phosphate phosphatase 3, LPP3）在多种器官纤维化过程中的脂质磷酸盐的生物合成以及细胞信号转导中发挥重要作用[22]。研究[21]发现患有DN的肥胖糖尿病小鼠中miRNA-184表达上调。在体外，miRNA-184表达增加导致LPP3表达减少而PAI-1表达增加。LPP3表达缺陷时β连环蛋白介导的T细胞因子（T cell factor, TCF）转录增加，且PAI-1的转录随之增加。而当TCF/β蛋白转录被抑制时，PAI-1转录增加的趋势也随之消失。说明LPP3通过调节TCF/β蛋白通路来调节PAI-1的转录，调节ECM的降解。在体外，miRNA-184可通过抑制其靶基因LPP3的表达引起PAI-1表达增加。因此miRNA-184通过抑制LPP3的表达促进TCF/β蛋白通路进而促进PAI-1的转录，抑制 ECM的降解，促进 DN的中的纤维化进程[18-21]。

3.6.2 miRNAs与ETS-1 E26致癌基因同源物1（E26 oncogene homolog 1, ETS1）作为原癌基因，能与编码蛋白酶的启动基因相互作用，在参与基质重塑及组织纤维化过程中发挥重要作用[23-24]。

miRNA-155在DN患者血清中的表达水平显著异常，提示miRNA-155可能与DN发病有关[23]。MMPs是一组能特异性降解ECM成分的蛋白酶家族。而基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase1, TIMP-1）是MMPS的特异性抑制物，是肾内ECM的代谢过程中MMPS的主要调节物质。而TIMP-2水平随DN病程进展进行性升高，可能在调节MMPs/TIMPs系统的平衡以及影响ECM代谢中发挥重要作用。ETS-1可增加MMP-1、MMP-2及TIMP-1、TIMP-2等基因的活化，促进组织纤维化[24]。王金华等[23]研究发现miRNA-155在DN小鼠模型血清和肾组织中表达增高。因此，miRNA-155可通过负性调控其靶基因ETS1，破坏MMPS/TIMPS的动态平衡，引起GMCs增生及ECM过度堆积，加速肾小球硬化及肾间质纤维化的发生。

研究[25]发现miRNA-192在确诊DN的人类和小鼠肾脏中的丰度均增加，且miRNA-192的丰度增加与蛋白尿及间质纤维化相关。miRNA-192靶向作用于E-box结合锌指蛋白同源盒2（Zinc finger E-boxbinding homeobox 2, ZEB2）。Zeb2通过抑制 E-box来抑制小鼠GMCs中编码1型胶原蛋白α2的基因的表达。因此miRNA-192对Zeb2的负性调节增加了ECM蛋白的表达。此外，miRNA-192还能诱导其他肾脏 miRNAs如 miRNA-200b，miRNA-200c，miRNA-216a及miRNA-217的丰度增加，而miRNA-200b和miRNA-200c可以通过靶向作用于GMCs中的E-box抑制剂（zeb1和zeb2）来增加胶原蛋白及TGF-β的表达。因此纤维化反应又得到了进一步放大。另外，miRNA-216a和miRNA-217可以通过靶向作用于糖尿病小鼠GMCs中的具有磷酸酯酶活性的人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosometen, PTEN）来活化丝/苏氨酸蛋白激酶（serine-threonine kinase, Akt），Akt的活化也能参与肾脏纤维化过程。由miRNA-192触发的这些miRNA级联反应在DN的纤维化和肥厚增生过程中发挥重要作用[25-26]。研究还证实TGF-β引起Akt的活化，Akt进而磷酸化并激活乙酰转移酶p300，引发转录因子Ets-1和组蛋白H3的乙酰化（Ets-1通过调节MMPs及ECM蛋白来促进基质重构，进而参与纤维化过程），最终促进了miRNA-192的持续表达[25]。

3.6.3 miRNAs与CTGF 连接组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）是组织损伤和修复过程中纤维细胞的活化标志，被证明与足细胞损伤相关。高糖状态下，CTGF的表达在足细胞、系膜细胞和肾小管间质细胞中表达显著增加[27]。

KOGA等[28]发现在DN小鼠中miRNA-26a表达下调，且miRNA-26a能与CTGF结合从而抑制其转录后翻译。CTGF可通过促进TGF-β与其受体结合从而活化TGF-β/smad信号通路，导致TGF-β诱导的纤维化进一步加剧。miRNA-26a可通过直接抑制CTGF表达来抑制足细胞中TGF-β/smad信号通路，从而抑制ECM聚集和纤维化。因此，调节miRNA-26a的表达也许可以成为DN新的诊疗方向。

3.6.4 miRNAs与G3BP2 Ras-GTP酶活化蛋白SH3结构域结合蛋白2（Ras-GTPase-activating protein SH3 domain-binding protein, G3BP2）被发现可调控p38MAPK信号通路。丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）信号通路是一组可将细胞外信号转导至胞内的丝/苏氨酸蛋白激酶，调控多种细胞功能[29-30]。

ZHAO等[29]研究发现在患有DN的人类及小鼠中miRNA-23b呈低水平表达。过表达miRNA-23b可改善其大量蛋白尿及肾脏纤维化等病理变化。miRNA-23b对其靶基因G3BP2进行负性调控。P38MAPK信号通路已知与DN中GMCs增生及ECM堆积相关。研究发现p38MAPK是G3BP2的下游靶点，而p53又是p38MAPK信号通路的下游靶点[29-31]。因此，miRNA-23b抑制其靶基因G3BP2的表达，G3BP2表达减少引起下游p38MAPK表达减少，从而导致其下游靶分子p53表达减少，p53表达的减少又反过来引起miRNA-23b表达增加，从而形成一个循环回路。而在DN中，miRNA-23b的低水平表达则导致G3BP2、p38MAPK及p53等下游分子表达均增多，最终反馈抑制miRNA-23b的表达且促进了肾脏纤维化等病理过程。

3.6.5 miRNAs与GAS1 生长停滞特异基因1（growth arrest-specific gene 1, GAS-1）可抑制细胞增殖等。在DN中可抑制GMCs过度增殖及ECM的产生[32]。

有研究表明，miRNA-34a可通过抑制其靶基因GAS1的表达促进GMCs的增生及肾小球肥厚[32]。然而，ZHANG等[33]发现高糖状态下足细胞中miRNA-34a的表达量明显减少。在DN中，Notch信号转导通路通过影响血管生成和胰腺内分泌及外分泌细胞发生、介导肾小球功能损伤和足细胞凋亡、促进肾小管间质损伤和纤维化进展。而miRNA-34a可以抑制肾小球足细胞中notch信号通路的活化，减少足细胞损伤以及ECM的过度堆积，从而延缓肾小球纤维化的进展，延缓DN的发展。

3.7 miRNAs与糖尿病肾病的自噬反应

自噬是生物体降解自身细胞质蛋白或细胞器的过程，对细胞内物质代谢及维持细胞内环境稳态十分重要。DN组织中，诱导细胞自噬的损伤因素增多，但对于细胞具有保护作用的自噬功能却处于被抑制的状态，这种失衡状态促进DN发生[34]。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）是调控细胞能量稳态的重要激酶，它的活化对自噬具有正性调节作用。激活AMPK信号通路有助于改善GMCs自噬作用的缺陷[35-36]。杜小燕等[36]发现miRNA-101在高糖状态下的GMCs中表达量增加，miRNA-101直接靶向调控AMPK的表达，降低AMPK及其蛋白的表达水平，导致高糖状态下GMCs的自噬反应被抑制，而GMCs的增殖能力则增强，ECM生成增多。这说明miRNA-101可能通过负性调节AMPK促进DN的发生、发展。

4 尿液外泌体miRNAs

尿液中有包含复杂RNA和蛋白质的杯状囊泡，即外泌体，其可参与细胞间通讯。尿液外泌体中的miRNAs十分稳定，不易被降解。近年来陆续有研究发现DN患者的尿液外泌体中miRNAs表达异常。

尿液外泌体中的miRNA-145的表达在人类糖尿病患者及实验性糖尿病小鼠模型中均显著升高。研究证实miRNA-145是TGF-β1的一个作用靶点，miRNA-145在GMCs中的表达量的增加与TGF-β1/smad信号通路相关[37]。另外有研究[38]发现，在2型糖尿病引起的DN患者尿液外泌体中miR-362-3p、miR-877-3p和miR-150-5p表达上调同时miR-15a-5p的表达下调。这些miRNAs可能通过mTOR、AMPK信号通路等调节DN的发展。

5 展望

本文综述了近年来新发现的与DN相关的miRNAs，从中可以窥见，miRNAs对于DN发病前的预防，发病早期的诊断以及发病后的合理治疗均具有重要价值。

而对于其他除血液及组织之外如尿液外泌体中的miRNAs，目前也已有相关研究陆续涉足其中，但相关研究还十分局限，仍需深入探索。同一miRNA在不同的体液中表达情况可能截然相反，其作用机制也不全相同。不同的miRNAs在可以在相同的体液中有相同的表达趋势，甚至其作用机制也大致相似。因此，尽管目前关于miRNA与DN的研究已十分丰富，但从不同的着眼点入手，仍然可以发掘出相对广阔的研究空间。