奶牛早期妊娠诊断技术的研究进展

陈超，张欣欣，安志高，胡祥维，华丽萍，李可可，杨利国

（华中农业大学动物科技学院，武汉 430070）

随着经济的高速发展和生活水平的不断提高，人们对于乳制品的需求量越来越大，要求也越来越高，这也对奶牛养殖业的发展提出了更高的要求，所以为了满足社会发展的需要，需不断推进奶牛养殖的现代化和科学化。经过半个多世纪的发展，中国奶牛产业已经从传统、落后、粗放的养殖模式转变成规模化、标准化、精细化、产业化养殖的模式，很多先进技术也得到了大力的推广[1]，其中早期妊娠诊断技术在近些年也得到了快速的发展。

早期妊娠诊断技术在畜牧养殖业中一直扮演着重要的角色，特别是在奶牛养殖业中。母牛在配种后应尽早地确定是否妊娠，这对于保胎、减少空怀、提高母畜的繁殖力是非常重要的[2]。经过早期妊娠诊断，对于确定怀孕的母牛，尽早提供妊娠母牛所需要的营养与环境，加强饲养管理，能够保证胎儿的正常发育，避免胚胎的早期死亡或流产；对于未妊娠的母牛，找出原因后及时采取措施进行二次配种，对于多次配种不孕的母牛及时淘汰，通过缩短产犊间隔而达到提高母牛繁殖效率的目的。简便有效的妊娠诊断方法，尤其是早期妊娠的诊断方法，能够大大提高母畜的繁殖效率。母畜繁殖效率一直是畜牧生产中极为重视的问题，繁殖效率的提高能大大提高畜牧生产的经济效益。早期妊娠诊断的准确性也是至关重要的，如果发生妊娠诊断错误，将会造成发情母畜的失配和已妊娠母畜的误配，从而人为地延长产犊间隔，影响经济效益。

近年来，研究人员针对奶牛的早期妊娠诊断技术进行了诸多研究，以期找到一种快速、简便和经济的临床方法对奶牛早期妊娠情况进行诊断。

1 早期妊娠诊断的直接方法

早期妊娠诊断的直接方法是通过手动或借助电子仪器直接对母畜进行检测的过程。直肠触诊法和超声波诊断法是目前用于早期诊断妊娠的两种主要直接方法。直接方法的优点在于能够直接在动物个体上进行操作，操作过程比较简单，得出结果迅速。缺点是该方法需要有足够的生产实践经验与技术专长才能保证诊断的准确性。有研究报道，操作者的熟练程度以及授精后的技术执行阶段会影响检测的特异性和灵敏度，有经验的技术人员可以用这两种方法获得高灵敏度和特异性[3]。

1.1 直肠触诊

经直肠触诊子宫用于牛的妊娠诊断最早始于19世纪，是最早且最广泛应用于奶牛早期妊娠诊断的直接方法。尽管随着早期妊娠诊断技术的发展，妊娠诊断的方法也不再单一，但直肠触诊法仍然是技术人员选择妊娠诊断的常用方法，主要是由于它不需要在实验室中操作和复杂的设备，而且可以快速得出结果。通过直肠触诊法进行妊娠诊断是基于检测到妊娠的四种阳性标志中的至少一种：羊膜、羊膜囊泡、胎盘组织和胎儿[4]。直肠触诊在奶牛生产中不仅仅用于妊娠诊断，还可以用于相关繁殖疾病的检查。梁国鹏等[5]研究证明直肠触诊能有效用于母牛卵巢以及繁殖疾病的诊断。

在一些研究中发现，通过直肠触诊检查妊娠早期的母牛会增加医源性流产的风险[6,7]，而有另外一些研究报道，妊娠母牛经直肠羊囊膜触诊对于随后的妊娠流产没有影响[8]。尽管关于经直肠触诊引起母牛的医源性流产的程度仍存在争议，但由于其使用的广泛性，以及进行直肠触诊检查的技术工作者都是经过专业培训的，有着丰富的实践生产经验，加上直肠触诊具有较高的准确性和低成本等优点，所以经直肠触诊仍然是奶牛妊娠诊断的常用方法。

1.2 超声波检查

超声诊断起源于20世纪40年代，50年代初期A型超声诊断法首先应用于临床，不久B型和D型超声诊断法相继问世。70年代B型速成法兴起，80年代初脉冲多普勒D型超声法试用成功[9]。近年来，随着超声波技术的发展，畜牧生产中对该技术的需求也日益增加，尤其是在牛的妊娠诊断方面。利用该方法诊断的常用仪器主要有A超、B超以及D超（多普勒超声）仪，其中多普勒超声和B超仪在畜牧生产中应用比较广泛。随着B超和D超的发展，A超在早期妊娠诊断中的应用逐渐减少。超声波检查法相对于直肠触诊法来说，其优点是准确性高，对母牛和胚胎无损伤等，缺点是操作需借助仪器，成本较高等。

B超进行早期妊娠诊断具有快速、直观、准确、无损伤等优点[10]，近年来在奶牛生产中的应用越来越广泛，技术也越来越成熟，大大提高了奶牛的繁殖效率以及奶牛养殖业的生产效益。贾国慧等[11]用B超技术对126头奶牛进行妊娠诊断，26～28d的诊断准确率为90.48%，29～31d、32～60d的诊断准确率均为100%。邓干臻[12]等对137头黑白花奶牛进行配种后，在26～30d进行妊娠检查，确诊率高达88.9%，高于50日龄左右的直肠检查准确率；配种后31～35d时的确诊率为97.2%，配种后35d以上的确诊率达到100%。以上数据均表明利用B超技术能够在母牛妊娠早期进行较为准确的诊断。B超除了在早期妊娠诊断上得到广泛应用外，还用于胎儿性别鉴定、生殖疾病检查等方面[13]，在动物生产中有着重要意义。

D型超声波是利用多普勒效应原理，对运动的脏器和血流进行检测的仪器，多普勒D型仪可通过测定母畜和胎儿血流量及胎动周期诊断是否妊娠。多普勒超声检查具有高性能、多功能、高分辨率、高清晰度等特点，诊断准确度高。但目前由于D型超声波仪器造价高以及操作等方面的问题导致D超在畜牧业的应用较少，但在人类各种疾病的检查中广泛使用。

2 早期妊娠诊断的间接方法

早期妊娠诊断的间接方法是使用母体体液中的一些激素等特异性物质的定性或定量测定值作为母畜妊娠的指标。间接方法的优点主要在于可同时进行大批量的妊娠诊断并且不用直接接触母畜；缺点在于需要借助一些仪器并且前期需要进行大量实验来确定妊娠阳性指标。间接方法的研究主要是为了能够进行商业化大批量早期妊娠诊断，提高诊断效率，减少人工和成本消耗，增加企业收益。

2.1 孕酮检测

黄体酮是生物活性最强的孕激素，主要在母牛发情周期和妊娠期胎盘期间由黄体产生和分泌。使用放射免疫测定（RIA）或酶联免疫吸附测定（ELISA）方法可以在实验室中对血液或牛奶中的黄体酮进行定量[3]。1959年Yalow首次创立了RIA，由于RIA灵敏度和精确度高，重复性好，其应用日益广泛。1971年英国的Laing等首次将RIA用于牛乳中孕酮(P4)的测定，并首次证明了乳中P4浓度所反映的发情周期阶段与直接卵巢的评估结果相一致[14]。Hoffmann等为排除乳脂率对测定结果的影响，1976年建立了乳脂孕酮测定的方法[15]。

丁红[16]等用RIA方法测定703头配种后21～24d母牛乳中孕酮含量，通过研究，确定乳脂孕酮的判断值大于1.0ng/10µL为妊娠，小于0.8ng/10µL为未妊娠，0.8～1.0ng/10µL为可疑；利用乳脂孕酮值判别为妊娠的准确率为88.6%，未妊娠的准确率为97.4%。吴凌[17]等利用自建的奶牛乳汁孕酮竞争ELISA法(酶标抗原法)研发了奶牛乳汁孕酮ELISA试剂盒，应用该试剂盒检测乳汁孕酮诊断奶牛妊娠与未妊娠的准确率分别为93.3%和95.8%。

2.2 妊娠相关糖蛋白（PAG）检测

牛PAG是对奶牛进行间接早期妊娠诊断的试验中发现的。分子克隆和测序研究表明，PAG属于家养反刍动物胎盘表达的一大类非活动性天冬氨酸蛋白酶，在牛中，PAG基因家族至少包含22个转录基因以及一些变异体[18]。牛PAG已经被免疫定位于胎儿子叶绒毛中存在的滋养层双核细胞，并从滋养外胚层向子宫上皮的双核细胞迁移，允许含有颗粒的具有胞吐作用的PAG进入母体循环[19]。

李艳艳等[20]用牛妊娠相关糖蛋白ELISA试剂盒检测配种后28～45d的273头荷斯坦牛血清中PAG的含量来进行妊娠诊断，并与75d直肠妊娠检查结果进行验证，结果发现牛PAG ELISA早孕检测试剂盒妊娠诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%，证明妊娠相关糖蛋白试剂盒可以准确诊断出空怀奶牛，可用于奶牛的早期妊娠诊断。薄小辉等[21]采集49头人工授精后28～32d奶牛血液样品，分离血清并应用PAG检测试剂盒进行检测，结果表明人工授精后28～32d，PAG检测试剂盒检测奶牛早期妊娠的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确性分别为92.0%、95.8%、95.8%、92.0%、93.9%，与B超检测方法的结果一致。

2.3 血小板计数

血小板计数法可进行早期妊娠诊断，其技术原理是血小板数量受着床前胚胎释放的一种中性类脂影响[22]。有研究报道血小板显著减少是怀孕早期特有的一种妊娠反应，根据血小板数量是否显著减少就可在配种后数小时至数天内对母畜做出受精检查及超早期妊娠诊断[23]。妊娠早期的血小板数减少，是母体对妊娠做出的最初的全身性反应，而且是各种动物仅有的早孕性生理变化，故利用血小板计数法可以进行超早期妊娠诊断。李助南等[24]用此方法对30头受配母牛进行了超早期妊娠诊断，经与直肠检查结果相比较，妊娠母牛符合率为86.36%。经探讨，该法与直肠检查结果有差异的原因可能是胚胎早期死亡。

3 问题与展望

目前，虽然已经建立了多种奶牛早期妊娠诊断的方法，但是都或多或少存在一些缺点，不能满足现代奶牛养殖要求。直肠检查法虽然应用最广泛，但其存在早期妊娠诊断结果准确性不高并且易造成胚胎损失等缺点；超声波检测相对于直肠检查能够有效降低胚胎损失，但是操作时需要具有丰富经验的技术人员和昂贵的器材；已有的实验室方法虽然能满足准确、灵敏地进行早期妊娠诊断要求，但都存在耗时长、不能现场检测等问题[25]。尽管妊娠诊断技术近几年在畜牧业中得到了迅速的发展，方法也是多种多样，但是目前还没有一种理想的早期妊娠诊断技术在实践中得以应用。理想的早期妊娠诊断技术应具备以下条件：首先在配种后的一个发情期内应显示出诊断结果，其次对于妊娠和未妊娠动物的诊断准确率在90%以上，还需对母体和胎儿安全无害，最后要做到操作简便、低成本高效益。不论哪一种妊娠诊断方法，只有符合上述条件才能在生产实践中得到广泛推广应用。为此，国内外众多学者都在为这样的一个目标投身到科学研究当中，期望寻找到一种快速、准确、简便、实用、经济的早期妊娠诊断方法。