肠道病毒71型感染致中枢神经系统损害的免疫发病机制①

张建华 徐 莲 黄慧琪 潘 密 楼超楠

(绍兴文理学院医学院医学免疫学教研室，绍兴 312000)

肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科、肠道病毒属成员，是一种无包膜、单股正链RNA病毒。自1974年Schmidt等[1]首次报道以来，EV71已在世界范围内，尤其在亚太地区引起多次暴发流行[2]。EV71感染可引起手足口病(HFMD)，患者以5岁以下婴幼儿多见。除EV71外，柯萨奇病毒A16(CA16)等其他肠道病毒也是引起HFMD的重要病原体，但EV71感染更易引起中枢神经系统并发症，有较高的病死率和致残率[3]。2008～2012年，我国大陆地区所有HFMD轻症病例中，EV71感染占45%，重症病例中占80%，死亡病例中占93%[4]。目前，EV71感染的发病机制仍不十分清楚，临床上缺乏高效特异的抗病毒药物。众所周知，宿主免疫应答是清除病毒感染或防止再次感染的最好方式，但在抗病毒免疫应答过程中，多种免疫因素可参与组织病理损伤，可能与EV71感染所致的中枢神经系统并发症密切相关。本文对EV71感染相关的中枢神经系统并发症及其免疫学发病机制研究相关进展综述如下。

1 EV71感染相关的神经系统并发症

EV71感染引起的临床表现通常是轻微的，呈自限性，包括HFMD与疱疹性咽峡炎。少数病例，尤其是3岁以下患儿，可引起严重的神经系统并发症，极少数病例病情危重，可导致死亡，中枢神经系统感染并发心肺衰竭是主要死因[5]。因此，EV71已被公认为是继脊髓灰质炎病毒消灭后最重要的嗜神经病毒。在EV71感染相关的神经系统并发症中，脑干脑炎十分常见，患儿常表现为肌阵挛、眼球震颤、呕吐、共济失调、颤动等。偶尔可引发自主神经功能障碍，如肺出血或肺水肿(神经源性肺水肿)，起病急，进展快，病死率高达80%～90%，幸存者均有显著的神经系统后遗症[6]。无菌性脑膜炎也是常见的神经系统并发症之一，患者常表现为剧烈头痛、伴发热、呕吐、颈项强直等，该病预后良好，多无神经系统后遗症[7]。EV71感染与脊髓灰质炎病毒类似，也可引起急性弛缓性麻痹，相比脊髓灰质炎，EV71所致的急性弛缓性麻痹临床症状较轻，较少出现永久性肢体瘫痪后遗症[5]。此外，吉兰-巴雷综合症与横贯性脊髓炎也是EV71感染相关的神经系统并发症。

2 EV71致神经系统损害的免疫学发病机制

与脊髓灰质炎病毒类似，EV71主要通过粪-口途径传播，病毒首先在鼻咽部、胃肠道黏膜相关淋巴组织增殖后释放入血，经过两次病毒血症，最终侵入靶组织，少数病毒可以突破血脑屏障或经周围神经途径逆向轴突输送引起中枢神经系统感染[8]。病毒侵入神经元细胞后大量复制，直接导致组织细胞损伤，但有大量证据显示，免疫学机制也介导了中枢神经组织的损害[9]。

2.1宿主免疫相关易感基因多态性 相同EV71基因型感染在不同宿主可出现不同程度的临床类型，有的无临床症状，有的可出现严重的神经系统并发症，甚至死亡；从而推测，宿主的免疫反应可能是疾病严重程度的决定因素。

2.1.1模式识别受体基因 天然免疫应答水平与病毒感染的发生发展紧密相关，病毒侵入机体后，免疫细胞或宿主细胞通过模式识别受体(PRR)识别病毒相关组分，从而启动天然免疫应答。Pang等[10]调查了三种PRR基因多态性与EV71感染疾病严重程度的相关性，包括Toll样受体3(TLR3)、维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)与黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)。结果显示，MDA5基因多态性与EV71重症感染紧密相关。MDA5对于RNA病毒感染诱导Ⅰ型IFN的产生十分重要，已有研究证明，MDA5参与EV71 RNA介导的干扰素调节因子3(IRF3)激活与IFN-β转录，过表达后可以逆转EV71感染导致的IRF3活化抑制状态[11]。因此，MDA5基因多态性以及相应的固有免疫逃避机制值得进一步关注。最近，王春阳等[12]研究发现，EV71感染宿主细胞后可通过降低IRF9来抑制IFN-β诱导的干扰素刺激基因(ISGs)表达，从而逃避抗病毒固有免疫应答。

2.1.2人类白细胞抗原基因 人类白细胞抗原(HLA)是人体对疾病易感性的主要遗传学成分，带有HLA特定等位基因的人体往往与某一疾病易感性相关。已有研究表明，HLA-A33与EV71感染宿主易感性最为相关，而HLA-A2与EV71感染致心肺衰竭密切相关，推测EV71特异性细胞免疫应答水平与疾病严重程度存在某种关联[13]。此外，HLA-G基因多态性也与EV71重症感染有关。陈晓晴等[14]发现，HLA-G的14 bp插入/缺失多态性(位于第3 742 bp处存在一个长度为14 bp的插入或缺失)与EV71感染严重程度密切相关，EV71感染重症病例中，14 bp-/-基因型显著增加。HLA-G是一种重要的免疫耐受分子，可抑制多种免疫细胞功能，病毒感染后可借助HLA-G分子逃避宿主抗病毒免疫攻击。Zheng等[15]比较了EV71感染所致脑干脑炎患者与神经源性肺水肿患者的HLA-G表达水平，发现后者的外周血单核细胞表面、血浆中HLA-G表达水平显著升高，提示HLA-G与EV71感染的疾病严重程度紧密相关。

2.2体液免疫 通常认为，体液免疫状态与EV71感染所致的神经系统并发症没有关联。Chang等[16]评估了EV71感染患者病毒特异性细胞免疫和体液免疫水平与疾病严重程度的关联性，发现普通病例(无神经系统并发症)、重症病例(较轻的神经系统并发症)、危重病例(脑干脑炎伴神经源性肺水肿)之间中和抗体水平无显著性差异。但是，仅仅从病毒特异性中和抗体角度否认体液免疫参与神经系统损害有失偏颇。Xie等[17]发现，重症病例的感染急性期B细胞的数量、比例以及血清总IgG含量均显著高于普通病例组，随着感染进入恢复期，中和抗体滴度上升，上述指标恢复正常，说明体液免疫与EV71感染引起神经系统并发症是有关联的。

2.2.1EV71特异性抗体介导的神经系统自身免疫病理损伤 病毒抗原可能与宿主细胞存在共同表位，从而通过交叉反应造成自身免疫病理损伤。Jia等[18]研究发现，EV71特异性IgG与人脑组织存在交叉反应，随后对相应抗原肽段进行定位，发现有4个肽段(分别来自VP2、VP1、2A与2C)可引发强烈的交叉反应。进一步利用EV71乳鼠感染模型证实，病毒感染可提高血脑屏障通透性，使得EV71特异性IgG进入脑组织并出现交叉反应。这些具有自身反应性的病毒抗体究竟可以结合到何处值得进一步探讨。Fan等[19]利用生物信息学技术对EV71与人类蛋白数据库进行比对，在VP1中获得一个共同表位；相应单克隆抗体可有效结合至中介复合体亚基25(MED25)，而后者在脑干组织中高水平表达；体内实验也证实，EV71感染小鼠7 d后静脉注射该单抗，可分布在小鼠脑干区域；并且在EV71感染患者血清中也发现了类似抗体。这些发现意味着EV71感染致神经系统损伤的机制中可能涉及自身免疫因素。

2.2.2EV71特异性抗体介导的抗体依赖性增强作用 在病毒感染过程中，某些特异性抗体可发挥抗体依赖性增强作用(ADE)，并且在多种病毒感染过程中得到证实，如登革病毒、呼吸道合胞病毒、埃博拉病毒等[20,21]。小RNA病毒科成员如口蹄疫病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒B组等，也有关于ADE的报道。Han等[22]发现亚中和抗体可增强EV71对THP-1细胞的感染，并可增加EV71感染的乳鼠死亡率，此外，他们建立了EV71再次感染的乳鼠模型，认为EV71初次感染产生的抗体可以增加再次感染的死亡率。基于这一研究结论，Cao等[23]进一步分析了EV71抗体不同亚类的中和作用与ADE效应的关系，发现IgG3无中和活性，但有显著的ADE效应。ADE的效应机制通常由免疫细胞或宿主细胞表面的IgG Fc受体(FcγR)介导，而FcγR也在中枢神经组织中表达，当病毒侵入中枢神经系统后，是否也存在类似的ADE现象是个值得探讨的问题。

2.3细胞免疫 大多数研究认为，细胞免疫水平与EV71感染严重程度紧密相关。来自我国台湾的两项研究均显示，EV71感染引起的脑干脑炎伴肺水肿患者外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞数量与比例，以及植物血凝素(PHA)刺激指数均显著降低，同时伴随着细胞因子的动态变化，尤其是患者血浆IL-10、IL-13与IFN-γ显著升高。他们认为，淋巴细胞损耗与细胞因子异常可能是EV71相关的神经源性肺水肿的关键发病机制[16,24]。动物模型研究也支持这一结论，有人发现，利用EV71感染CD4或CD8缺陷的小鼠时症状更严重[25]。另一方面，有人比较了不同毒力EV71临床分离毒株感染乳鼠时的T细胞亚群差异，结果发现，与弱毒株相比，强毒株可以显著增加宿主CD4+T细胞水平，但CD8+T细胞、NK细胞水平没有差异[26]。

CD4+T细胞在适应性免疫中起到核心作用，对于抗体或CTL应答均有辅助作用，同时，CD4+T细胞介导的免疫应答在病毒感染相关的免疫病理机制中也有重要作用。Wei等[27]在EV71多聚蛋白中鉴定获得一系列CD4+T细胞表位，其中有一个表位(记作A3)在肠道病毒属成员中高度保守，包括柯萨奇病毒、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒，尤其是脊髓灰质炎病毒3型Sabin株，作为疫苗免疫接种后，可对EV71感染起到一定的保护作用，他们推测，EV71感染后大部分患者临床表现轻微，可能与脊髓灰质炎疫苗接种以及其他肠道病毒感染有关。然而该研究小组随后的一项临床研究认为，A3表位可以引起EV71特异性Th2型应答，抗原刺激后IL-4表达升高，并且与患者发热时间显著相关，据此作者认为该表位特异的Th2应答与EV71感染预后不良有关[28]。这种保守表位的特异性免疫究竟属于保护性的还是参与病理损伤仍然是模糊的。

T细胞亚群失衡也可能与EV71感染免疫病理过程有关。Li等[29]调查了EV71感染后患者外周血T细胞亚群及相关细胞因子水平，发现与对照组相比，EV71感染患者Th1、Tc1细胞数量显著增加，Th1/Th2比率以及IFN-γ增高；重症病例与普通病例、对照组相比，Th17比例与IL-17A水平升高，相应的Th17/Treg比率也增高，暗示T细胞亚群失衡可能与EV71感染免疫病理机制有关。

2.4细胞因子与趋化因子 细胞因子在病毒感染诱导的免疫应答中的作用十分复杂，许多细胞因子既涉及到免疫应答的启动与调节，也可直接或间接抑制病毒复制。在异常情况下，促炎细胞因子与抗炎细胞因子之间平衡失调，体液中多种促炎细胞因子过量产生，导致组织损伤。越来越多的证据显示，细胞因子异常与EV71感染相关中枢神经系统并发症相关[30]。EV71感染患者的血清与脑脊液中可以检出高水平的IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13、G-CSF、IFN-γ及TNF-α[24,31-33]，尤其是脑脊液中IL-1β、IL-6与TNF-α的水平，在EV71感染并发的脑干脑炎、神经源性肺水肿患者中显著升高，两者高度相关[34,35]。由此可以推断，致炎细胞因子水平与EV71感染临床严重程度是紧密相关的。这些细胞因子参与EV71感染发病的机制在动物模型中得到进一步证实，Khong等[36]在EV71乳鼠感染模型中，观察到血清中持续出现高水平的IL-6，注射IL-6单克隆抗体后可以显著降低死亡率，减轻组织损害程度。

趋化因子可以募集淋巴细胞至感染局部组织，促进抗病毒免疫应答产生。有研究显示，EV71感染IP-10基因敲除的小鼠，可降低MIG、IFN-γ水平以及CD8+T细胞数量，减缓病毒清除速度，显著增加死亡率[37]。但趋化因子水平异常也可能是参与致病的免疫学因素。有研究显示，CXCL8、CCL2/MCP-1、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10等在EV71感染合并肺水肿患者的血清与脑脊液中均显著上调[38,39]，其中MCP-1的过表达在EV71感染小鼠模型中得到证实[40]。另有研究表明CXCL8、RANTES的表达水平与疾病严重程度相关，其水平的升高预示着病情由轻症向重症的发展趋势，可见，CXCL8、RANTES参与了EV71感染重症化的病理过程[41]。

3 结语

很显然，病毒感染诱导的免疫应答在限制病毒感染、降低病毒负荷、减轻组织损伤等方面是十分有效的，另一方面，在清除病毒感染的同时，激活的免疫细胞以及释放的应答产物也是其致病机制的一部分。综上所述，EV71感染所致的中枢神经系统损害与异常的免疫应答紧密相关，但其确切机制仍然不清。绝大多数结论来自临床研究，仅限于关联性研究，因果关系并不明确。尽管体外及动物实验取得了一定的进展，但鉴于动物模型本身的限制，与人体真实病理状态相差甚远，相应的研究结论仍然缺乏说服力。病毒特异性抗体、T淋巴细胞应答以及细胞因子失衡等在EV71致病机制中的作用仍然值得进一步探讨。此外，未来研究应进一步关注免疫应答相关的遗传学研究，突出个体因素在EV71感染发生发展中的作用。