猪精液冷冻保存技术的研究进展

刘韶娜，赵智勇，张 斌，相德才，赵彦光

（云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224）

1 猪精液冷冻保存技术的进程

随着人工授精技术的推广和应用，猪的精液保存技术也逐渐发展，并日益受到关注。1787 年，意大利科学家Spallazani 首次对人和马的精液在-17 ℃下进行冷冻保存并发现有少数精子存活[1]，Luget和 Hodepp 研究发现-192 ℃条件下人的精子冷冻保存后仍旧有少数精子存活[2]，从而打开了精子冷冻保存的新篇章。1949 年，英国科学家Polge 等发现，甘油对牛的精子冷冻保存具有一定的保护作用，1970年第一次报导有人使用冻融后猪精液进行人工输精获得83%受精卵，成功使用冻精进行人工授精的仔猪生产，更加充分地证实了猪精子冻融后仍具有受精能力的观点[3-4]。我国从20 世纪70 年代开始液氮冻精技术的研究，20 世纪90 年代开始冻精技术逐渐开始由颗粒型转变为细管型[5]。近年来的研究显示猪精子冷冻保存精子存活率可达0.5 以上[6-8]。陈明明等研究优化精子基础稀释液、甘油浓度和解冻条件发现-80 ℃条件下，精子冷冻后活力可达到0.57[9]。查星琴[10]等对版纳微型猪近交系种公猪精液冷冻保存条件研究发现2%和3%的甘油对猪的精液均有良好的保护作用，而50 ℃ 6 s 和40 ℃ 6 s 的水浴解冻条件下精子活力、质膜完整率和顶体完整率均最高。随着科技的不断进步，猪的精液冷冻保存技术也越来越先进，在猪的生产中也得到了越来越多的使用。精液冷冻保存技术在奶牛生产中得到了全面的应用，但在猪的繁殖和品种改良方面运用率还较低，还需进一步研究[11]。因此，本研究拟从猪精液冷冻保存技术影响因素和存在问题等方面进行综述，为猪的精子冷冻保存技术研究提供理论依据、为进一步提高猪的精子冷冻保存技术，提高种猪生产性能而提供理论支持。

2 猪精液冷冻保存技术的影响因素

猪的精液冷冻保存一般采用颗粒保存、细管保存和扁平塑料袋保存3 种，生产实际最常用的是细管保存。精液冷冻保存的流程为：精液的质量检测、精液冷冻和精液解冻3 步。

2.1 精液的质量检测

精液的检测一般通过外观和显微镜检测两方面。外观检测一般通过颜色、气味、采精量和质地等几方面综合检测。一般猪的精液呈现出乳白色或者浅灰色，质地均匀无水乳分离现象，气味为略微腥味无腥臭或者恶臭味，一次容量为300 ～500 mL[5]。

精子的显微观察包括活率、密度和形态[11-12]。精子活率通常采用十级评分法评定，一般提前37 ℃预热，用BST 液稀释后，在400×倒置显微镜下观察。猪的精子密度一般为2 ～3 亿/mL，通常使用血细胞计数法来估算，一般通过稀释后在40×显微镜下观察[13]。形态观察则通过顶体完整率和精子畸形率来评定。一般精子畸形率应该低于18%[14]。

2.2 精液的稀释液和冷冻保护液

猪的精液稀释液主要成分包括：低密度脂蛋白、胆固醇、冷冻保存剂、多糖、抗氧化剂和缓冲液等[10,15-19]。当精液温度低于0 ℃后，会形成冰晶，细胞外产生冰晶，使得稀释液的渗透压发生变化，促使细胞产生渗透胁迫，而冷冻保护剂可以提高渗透压，使细胞通过渗透脱水，防止冰晶的产生，从而保护精子[20]。在冷冻稀释液中添加芝麻酚和番茄红素均能提高精液冷冻质量，能够提高解冻后的精液品质，而黄芩素则能在精液解冻过程中起保护作用[21]。糖类为非渗透性保护剂，常用作稀释液成分的有葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇等，能够提供能量维持代谢，如葡萄糖能够通过精子的质膜，利用糖酵解或三羧酸循环而给精子提供一定的能量[21]。姜泽研究发现添加2 mg/mL 的甘露醇能显著提高冷冻后精子的质膜完整率，可以缓解低温对精子活率、质膜及顶体完整性的损伤，减少精子凋亡基因的表达量，缓解精子的凋亡程度，从而提高受精率[21]。马红通过在民猪精液冷冻稀释液中添加0.15 mol/L 的海藻糖后发现均能提高精子活率、线粒体膜电位、顶体完整率和质膜完整率[17]。此外，各种单糖和多糖类，如葡萄糖、黄芪多糖、红景天多糖等均对精子冷冻有保护作用[23-27]。冷冻保护剂类常用的有甘油，卵黄等。其中甘油是目前猪的精液冷冻保存中最常见的成分之一[19]。卵黄在冷冻保护中主要有效成分为低密度脂蛋白，通过其粘附在精子的细胞膜上，在低温刺激的时候形成一种凝胶化状态的物质，同时精子膜上的部分磷脂被取代，降低精子膜温度的转变；可以与蛋白发生特异性结合，以此来阻止精子膜磷脂和胆固醇的外流，不同来源的卵黄由于各成分比例不同而保护的效果有差异。曹立鹏等发现添加9%鸽蛋来源的低密度脂蛋白对猪精子冷冻保存具有保护作用，解冻后精子活力特征显著高于其他组[26]。HU 等发现添加9%鸡蛋来源的低密度脂蛋白能显著提高猪精液冷冻保存的质量[27]。Bathgate则认为鸡蛋和鸭蛋来源的低密度脂蛋白对猪精子冷冻保存效果要优于鹌鹑蛋[28]。抗氧化剂类主要分两种，一类是酶类抗氧化剂，如：谷胱甘肽过氧化物酶和SOD 等；一类是非酶类抗氧化剂，如：谷胱甘肽、维生素C、维生素E、青花素等。抗氧化剂的主要作用是通过与精子呼吸代谢产物-活性氧结合，降低精子细胞膜的不饱和脂肪酸氧化，保护了精子结构的完整性[29]。孙燕青研究发现40 ug/mL 的葡萄籽原青花素能显著降低猪冷冻精液解冻后的畸形率，并显著提高精子活率和线粒体活性[30]。李世佳通过白藜芦醇对人的冷冻精子影响研究发现，白藜芦醇能降低冷冻损伤，改善冷冻后的精子质量和功能[31]。霍敏则认为辅酶Q 可以提高冷冻后的绒山羊精子质量[32]。

猪的精液冷冻剂型常见的有颗粒冻精、细管冻精和扁平塑料袋冻精。颗粒冻精常用一次稀释法制得，即将精液与稀释液按一定比例稀释后直接冷冻。扁平塑料袋精液常用两次稀释法制得，即将精液与第一稀释液按比例混合后，再与第二稀释液按比例混合后冷冻。细管保存一般分为0.25 mL 和0.50 mL，薛琦[33]研究猪精液冷冻保存后认为，-80 ℃冷冻保存时，两者无显著差异，-196 ℃冷冻保存时，0.50 mL细管冻精的冷冻效果明显优于0.25 mL。细管冻精也是实际生产中使用频率最高的一种冻精剂型，其具有冷却迅速，不易污染、使用方便和受胎率高的特点。

2.3 精液的冷冻

猪的精子对温度的下降速度非常敏感，温度的变化会影响部分蛋白的功能。当温度不高于15 ℃的时候，就会造成对精子的质膜损伤，精子细胞内容物向外流失，精子活率开始下降[34]。Althouse 则认为猪的精子临界温度是12 ℃[35]。当温度不高于5 ℃的时候，则影响Ca2+稳定状态、顶体及膜脂质完整性[36]，同时精子细胞膜上脂质分离，释放胆固醇，影响脂质和蛋白质间的相互作用[37]。所有的这些变化会影响某些蛋白质的功能。精子的冷冻保存一般是指-196 ℃的超低温液氮保存，在此温度条件下，精子进入玻璃化温度区，即精子膜两侧的液体同时固化为玻璃样固体，水分子形成坚硬均质的冰结，精子膜能维持正常构造，细胞不会脱水，所有细胞活动都会完全停止，因此理论上讲超低温冷冻精液可以无限期保存。0 ～-60 ℃是有害冰晶区，精子处于冰晶区的时间长短与冰晶大小成正比，对精子的损害也成正比，猪的精子冷冻过程中应该缩短在冰晶区的时间。

精液的冷冻方法一般包括程序冷冻法和液氮熏蒸法。程序冷冻法是通过控制液氮气化的速率来控制降温的速率，能够监控到温度的变化，但对仪器要求较高。液氮熏蒸法则是直接投放于液氮当中，迅速制冷，对仪器要求较低，操作简单，但降温速率不可控制。吴衍等研究发现程序冷冻法处理犬精液后精子质膜完整率和顶体完整率较高，冷冻效果优于液氮熏蒸法[38]，这是由于液氮熏蒸法依靠冷冻支架及细管离液氮面的距离来控制降温速率的，其受到影响因素大[39]。

2.4 冷冻精子的解冻

冷冻精子的解冻温度一般分为0 ～5 ℃、30 ～40 ℃（一般为37 ℃）和50 ～70 ℃。不同的温度对应的解冻时间也不一致。郑筱峰通过研究姜曲海猪冷冻精液的解冻条件发现，液氮中取出的冷冻精液37 ℃水浴后精子质量明显优于放置室温后37 ℃水浴[40]。高小莉则认为50 ℃为鸡的冷冻精液解冻的最佳温度[41]。凌培凤发现猪冷冻精液的最佳解冻温度为37 ℃ 30 s 和65 ℃ 5 s[42]。解冻时升温速度过快则造成精子内外渗透压不一致，能损坏细胞膜，而升温速度过慢细胞外液已形成冰晶。

冷冻精子的解冻方式分为干法解冻和湿法解冻。干法解冻是将解冻后的精子放入二氧化碳培养箱中抚育，湿法解冻是指将精子放到恒温水浴锅中。如果冻精封口不严，湿法解冻则会造成一定的应激。

3 猪精液冷冻保存技术存在的问题

3.1 对冷冻精液的设备要求

对于猪精液冷冻效果较好的程序冷冻法要求仪器能控制液氮的喷出量，从而控制精子冷冻的降温速率，但其价格昂贵，不能普及到猪场的实际应用上。

3.2 操作要求严格

冷冻精液的质量与其冷冻解冻的速率精密度成正比，尤其解冻的时间上要精确到秒，这对操作人员的操作水平要求极高，操作人员的技术水平与解冻后精子的质量成正比。

3.3 影响因素复杂

精液质量、稀释液成分，冷冻方式，解冻温度和时间及不同物种对冷冻精液的质量影响显著，目前还未有统一的标准。王雪晗发现冷冻时液氮面熏蒸高度距离3 cm，熏蒸时间9 min，解冻时38 ℃水浴20 s，精子的质量较好[15]。王捷发现冷冻精液稀释液中添加2.0 μmol/L 番茄红素、0.2 g/L 芝麻酚和0.04 g/L 黄芩素的对解冻后精子质量效果较好，添加0.2g/L 芝麻酚和2.0 μmol/L 番茄红素以及0.2 g/L 芝麻酚和2.5 μmol/L 番茄红素能提高解冻后精子抗氧化能力[22]。凌培凤发现同一冷冻液的猪冷冻精液的最佳解冻温度为37 ℃ 30 s 和65 ℃ 5 s[42]。

4 小结

目前有关猪的精液冷冻保存技术的研究较多，较多的研究在于不同条件对精液冷冻保存影响结果，但关于影响的机制研究较少，对影响机制的研究有助于从根本上提高精液冷冻保存技术，为畜牧业优良品种推广及种质资源保存做出贡献。