慢性乙型肝炎相关PD-1抑制性信号通路研究进展①

张林琳 方 峰

(华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科,武汉 430030)

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)是一种进展性疾病，乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染后，如不及时治疗，将可能发展为肝硬化、肝癌甚至肝功能衰竭。全世界约有20亿人感染乙肝病毒，其中近2.5亿人为慢性乙肝病毒感染患者[1]。慢性HBV感染患者的免疫特征是T细胞衰竭，在感染过程中，病毒特异性T细胞反应低下，阻碍了病毒的清除和肝炎的恢复。T细胞衰竭已被认为是T细胞功能障碍在慢性病毒感染中的一个重要机制[2]。而大量研究表明，程序性死亡受体-1(Programmed death-1，PD-1)作为活化T细胞表面的一种抑制性受体，通过与其配体PD-L结合，所传递的免疫抑制信号可负向调节T细胞的增殖、细胞因子分泌及细胞毒功能。故而此信号传导途径被认为与病毒感染慢性化有关。阻断PD-1信号通路能够重建T细胞功能，抑制病毒复制，促进病毒清除。这为慢性乙型肝炎的治疗提供了一个新的免疫策略。本文综述了近年来PD-1信号通路在慢性乙型肝炎中的作用机制及相关研究进展。

1 PD-1/PD-L生物学特征

程序性死亡受体-1(Programmed death-1，PD-1)也称 CD279，属于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，是一种分子量为50～55 kD的抑制性受体。广泛表达于多种免疫细胞包括 CD4+/CD8+T细胞、自然杀伤 T 细胞 (NKT细胞)、B 细胞以及单核细胞。PD-1细胞外区为免疫球蛋白样IgV区，胞质区为两个酪氨酸信号基序，一个为免疫受体酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)，另一个为免疫受体酪氨酸转换基序 (Immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM) 。

PD-1 配体(Ligand of programmed death-1，PD-L)包括两种亚型 (PD-L1 和PD-L2)，其中 PD-L1(CD274) 持续表达于 B 细胞、T 细胞、树突状细胞 (DC) 及巨噬细胞，并在细胞激活后上调表达，通过与PD-1结合抑制T、B细胞活性来防止自身免疫疾病的发生;而 PD-L2(CD273) 仅见于 DC 及巨噬细胞激活时被诱导表达，主要参与调控自然环境抗原引起的免疫反应[3]。

PD-1与激活T细胞的PD-L1结合后，其ITSM结构域中的酪氨酸发生磷酸化，导致由CD28介导的磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)发生去磷酸化，从而削弱TCR/CD28 信号对免疫细胞的活化作用，发挥负向调控T细胞活性的作用[4]。

2 PD-1介导T细胞功能衰竭的机制

2.1HBV感染导致T细胞衰竭 乙型肝炎病毒(HBV)是导致肝脏损伤和炎症的最常见的病毒。在感染急性期，初始T细胞在抗原刺激下分化成效应T细胞对HBV病毒进行有效清除。然而在慢性HBV感染中，由于病毒载量的增加、抗原的持续性刺激及炎症持续存在，机体不能对HBV病毒产生有效的免疫应答，在免疫清除和免疫耐受之间进行长期博弈，导致病毒特异性CD8+T细胞不能分化成为记忆性T细胞，而是以一种不同于效应T细胞和记忆性T细胞的分化类型存在——功能衰竭T细胞。这种T细胞效应功能逐步丧失最终发生凋亡即“T细胞衰竭”[5，6]。衰竭的T细胞高表达多种抑制性受体如程序性细胞死亡受体-1(PD-1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)、CD244 (2B4)、CD160等，其中PD-1被认为是衰竭T细胞的标志分子[7]。Barber等[8]在研究慢性感染淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)小鼠中，首次描述了在衰竭的CD8+T细胞上共抑制受体PD-1的高表达，且阻断PD-1通路后可部分恢复耗竭的T细胞功能。之后越来越多研究发现在慢性乙型肝炎中HBV特异性CD8+T细胞中多种抑制性受体高度表达，阻断PD-1/PD-L信号通路可恢复T细胞功能[9-11]。由此可见，PD-1抑制性调节信号通路在HBV特异性T细胞衰竭中发挥重要作用。

2.2功能衰竭T细胞高度表达PD-1 在慢性乙型肝炎中，HBV特异性T细胞功能低下与T细胞活化共刺激信号受到抑制有关。Bengsch等[9]对98例HLA-A2+慢性感染患者进行体外分析HBV特异性CD8+T细胞反应、多种抑制受体表达及T细胞分化标志物，发现HBV特异性CD8+T细胞表达多种抑制性受体( PD-1、2B4、Tim-3、CTLA-4和BTLA)，但以PD-1表达占主导地位，约为79.3%。体外阻断这些抑制性受体通路可以不同程度的恢复T细胞增殖能力及IFN-γ、TNF-α及IL-2等细胞因子分泌功能，但以阻断PD-1/PD-L1信号通路所产生的T细胞功能恢复效应最为显著。通过对其表型分析发现，HBV特异性CD8+T细胞 CD27+CCR7-CD45RA-表型占43.4%，CD27+CCR7+CD45RA-表型占30.4%，CD27-CCR7-CD45RA-表型仅占15.8%，且PD-1在CD27+CCR7-CD45RA-表型的T细胞中表达量最高。已知CD45RA+的T淋巴细胞具有较强的效应功能，可分泌IFN-γ和TNF-α，高表达穿孔素和颗粒酶等细胞毒分子。而在慢性乙型肝炎患者中，HBV特异性T细胞以CD27+CCR7-CD45RA-表型为主，这类T淋巴细胞分化不完全，不能发挥效应功能，且这类细胞高度表达PD-1抑制其增殖、分泌细胞因子及细胞毒功能，故而不能彻底清除HBV，使HBV持续存在。

Tang等[12]通过对CHB患者T细胞CD28家族受体表达谱进行研究，发现在慢性HBV感染时，CD4+和CD8+T细胞上PD-1的表达量增加，且HBeAg(+)患者CD8+T细胞PD-1表达水平明显高于HBeAg(-)患者，CD8+T细胞PD-1表达与HBV DNA滴度呈正相关。提示PD-1的高表达与慢性HBV感染有关，HBeAg(+)与HBV DNA促进PD-1的表达，导致T细胞损伤。Liu等[13]在研究弥漫型大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)合并乙型肝炎病毒(HBV)感染PD-1的表达与临床预后的关系中发现，HBsAg(+)组PD-1表达率明显高于HBsAg(-)组，且HBsAg(+)组的临床预后较HBsAg(-)组差。其结果表明PD-1的高表达可能与HBsAg(+)组患者的不良预后密切相关。因此，有针对性的PD-1治疗策略可以改善HBsAg(+) DLBCL患者的预后。

上述研究表明，PD-1的表达不仅由HBV特异性CD8+T细胞特异性表型决定，HBV病毒载量增加和抗原持续刺激也可促进T淋巴细胞表达PD-1。PD-1与其配体PD-L1结合后,通过招募SHP1和SHP2磷酸酶到酪氨酸磷酸化的ITIM和ITSM基序，终止ZAP70和PI3K磷酸化，直接抑制TCR/CD28信号转导[14]；此外，PD-1可促进CBL家族E3泛素连接酶的表达，使TCR链泛素化而不能识别抗原，间接抑制TCR/CD28信号转导；PD-1还可抑制CK2和CKD表达水平及活性，抑制PI3K-AKT-PKCθ通路，从而抑制T细胞生长。PD-1通过抑制上述信号通路抑制HBV特异性CD8+T细胞的增殖及功能，造成T细胞衰竭，从而无法对HBV病毒发挥效应。

2.3阻断PD-1信号通路可改善T细胞功能 多项体外研究证明，抑制PD-1/PD-L1信号通路可促进HBV特异性CD8+T细胞功能恢复，使T细胞增殖能力增加，IFN-γ及IL-2等细胞因子分泌增多[15,16]。在Tang等[12]的研究中还发现阻断PD-1/PD-L1通路后，CHB患者外周血CD4+T细胞功能增强。CD4+T细胞主要通过分泌细胞因子支持CD8+T细胞来参与抗病毒反应，CD4+T细胞功能的改善可能促进CD8+功能的恢复或逆转CD8+T细胞的衰竭。阻断PD-1/PD-L1信号通路后T-bet/GATA-3升高，CD4+T细胞中IFN-γ的表达明显增强,从而改善T细胞功能。这些数据表明PD-1/PD-L1阻断的作用机制可能是通过调节CD28家族的共刺激受体和共抑制受体的表达而实现的。提示CD28家族受体可作为快速监测慢性乙型肝炎治疗过程中T细胞功能变化的潜在临床指标。

2.4PD-1单核苷酸多态性与HBV易感性相关 PD-1作为一种调节T细胞活化和外周免疫耐受的免疫抑制分子，越来越多地被证明参与影响乙肝病毒感染的结局和病程。Li等[17]研究发现，PD-1基因3′-非翻译区(3′-UTR)rs 10204525的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)与慢性乙肝病毒感染的易感性和病程有关。

Zhang等[18]通过对157例中国汉族慢性乙型肝炎病毒感染者的PD-1 rs 10204525基因型进行检测发现，rs 10204525 AA基因型PD-1 mRNA水平显著高于AG 基因型及GG基因型；而正常对照组PD-1 mRNA水平与PD-1 rs 10204525基因型则无相关性。该研究结果提示，PD-1 rs10204525 AA基因型对HBV感染具有高易感性，可促进PD-1的表达，加快病程进展。

在其随后的研究中发现，用microRNA-4717转染慢性乙型肝炎患者PD-1 rs10204525 GG基因型的淋巴细胞，可使其PD-1表达水平明显降低，TNF-α及IFN-γ表达明显增多[19]；然而用miR-4717转染AA基因型的淋巴细胞则无明显变化，且慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞中miR-4717水平明显下降，该研究表明miR-4717在PD-13′UTR与SNP靶标rs10204525等位基因G发生特异性相互作用，从而调控PD-1基因表达，导致免疫调节的改变，影响慢性HBV感染的易感性和病程。

3 慢性乙型肝炎的治疗前景

慢性乙型肝炎是一种进展性疾病，如果不及时治疗将可能发展为肝硬化、肝癌甚至肝功能衰竭。已有研究资料显示HBV感染者病毒载量越高，疾病进展风险越大。因此，将HBV DNA长期控制在不可测的水平，可降低疾病进展的风险。《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[20]指出，目前我国治疗慢性乙型肝炎主要依赖于抗病毒治疗如干扰素类药物(普通INF-α和聚乙醇干扰素pegIFN-α)及核苷(酸)类似物(NAs)治疗。然而，这些抗病毒药物只能抑制却无法根除HBV，且由于患者耐药性、依赖性、免疫力和经济情况等的差异都可能导致治疗失败。因此，临床迫切需要确定新的治疗乙肝病毒感染的策略。

3.1PD-1/PD-L1信号通路阻断治疗 目前阻断PD-1/PD-L1信号通路治疗慢性病毒感染和癌症已呈现出广阔的应用前景。2014年美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)已批准两种PD-1阻断抗体(Pembrolizumab和Nivolumab)用于治疗晚期黑色素瘤、鳞状非小细胞肺癌和肾细胞癌[21]。2017年9月，美国FDA批准PD-1免疫检查点阻断剂(Nivolumab,Opdivo)用于治疗肝细胞性肝癌患者[22]。2018年6月15日，我国国家药品监督管理局(National Medical Products Administration，NMPA)批准纳武利尤单抗注射液(Nivolumab injection)用于治疗非小细胞肺癌成人患者。在慢性HBV感染中已有体外研究表明，PD-1信号通路阻断治疗可在一定程度上恢复病毒特异性CD8+T细胞的功能[23,24]。已有相关研究利用动物模型对使用PD-1阻断剂治疗慢性HBV感染的安全性和有效性进行评估，结果发现用抗PD-L1单克隆抗体疗法(aPD-L1)治疗旱獭肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus，WHV)感染的旱獭可恢复其T细胞功能，且不引起肝损伤[25,26]。在Liu等[27]的研究中发现，aPD-L1、恩替卡韦和治疗性疫苗联合应用与单用恩替卡韦或治疗性疫苗相比，能显著提高治疗效果，且不引起肝毒性。目前研究证明PD-1/PD-L1通路阻断可作为治疗慢性乙型病毒肝炎的一种新的治疗策略，值得进行进一步临床实验研究评估其疗效及安全性。

3.2HBV-pSTAT3-SALL4-miR-200c-PD-L1轴调节治疗 临床资料显示，PD-1/PD-L1的表达与肝细胞癌患者肿瘤大小、血管浸润、肿瘤分期呈正相关[28-30]。因此，肝细胞诱导PD-L1表达，CD8+T细胞诱导PD-1高表达被认为是CD8+T细胞衰竭的关键。Sun等[22]通过对98例HBV相关肝细胞癌患者进行临床队列研究，发现SALL4、PD-L1表达与miR-200c表达呈负相关，SALL4与PD-L1低表达、miR-200c高表达的患者存活时间更长。其研究发现miR-200c可直接靶向CD274(编码PD-L1)的3′-UTR，拮抗HBV介导的PD-L1表达，逆转CD8+T细胞衰竭。然而，miR-200c转录可被SALL4抑制，SALL4是一种锌指转录因子，调节胚胎干细胞的多能性和自我更新，SALL4在人胎肝中表达，在健康成人肝脏中不表达，但可通过HBV诱导的STAT3激活而重新表达，并通过其转录抑制功能直接抑制miR-200c的转录，进而造成PD-L1高表达和T细胞衰竭。由此，Sun等[22]提出HBV-pSTAT3-SALL4-miR-200c-PD-L1轴可调控PD-L1，并证实miR-200c过表达或SALL4沉默在恢复CD8+T细胞功能(特别是HBV特异性和记忆CD8+T细胞反应)和减少HBV复制方面具有治疗潜力，因此，肝内miR-200c治疗或中断SALL4再活化(SALL4沉默或SALL4抑制剂)可能成为治疗慢性乙型肝炎的潜在治疗策略。

4 结语

随着对HBV慢性感染相关机制的深入研究，T细胞衰竭在HBV感染慢性化过程中的作用越来越被研究者重视。在HBV慢性感染过程中，由于病毒抗原持续刺激，大量HBV特异性T淋巴细胞聚积在炎症局部，无法分化成记忆细胞，而是以一种衰竭T细胞(CD27+CCR7-CD45RA-)分化类型存在，这类衰竭的HBV特异性CD8+T细胞增殖能力及细胞毒功能低下，但大量分泌以PD-1为主的抑制性受体，与其配体结合后可对T细胞发挥抑制性调节作用，抑制TCR信号转导，使其分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子及细胞毒功能减弱甚至丧失从而处于一种“T细胞衰竭”的状态，阻断PD-1信号通路又可改善“T细胞衰竭”的状态，恢复T细胞效应功能，因此，PD-1/PD-L1信号通路阻断剂可能是治疗慢性乙型肝炎的一种可行性免疫治疗策略。然而，HBV慢性感染过程中T细胞调节机制错综复杂，多种调节信号通路同时参与其中形成网络调控。阻断PD-1/PD-L1信号通路的效应和安全性还需要进一步评价。继续探索PD-1抑制性信号通路导致T细胞衰竭的机制有助于深入理解慢性乙型肝炎的发病机理，制定新的治疗方案。