肿瘤突变负荷作为非小细胞肺癌免疫疗效预测标志物的研究进展①

吴 鹏 赵玉梅 杨玲麟

(西南医科大学附属医院肿瘤科，泸州 646000)

根据国际癌症研究机构(International agency for research on cancer，IARC)最新制定的GLOBOCAN 2018标准，肺癌仍然是全球发病率和死亡率最高的癌症(分别占11.6%、18.4%)[1]。其中，非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)约占85%[2]，且绝大多数患者就诊时已发展为晚期,既往晚期NSCLC的治疗手段主要为含铂双药化疗和分子靶向治疗，但二者目前均进入了瓶颈期[3]。随着免疫治疗的异军突起，特别是以程序性死亡受体-1(Programmed death-1，PD-1)/程序性死亡配体-1(Programmed death-ligand 1，PD-L1)为代表的免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint blockers,ICB)给部分NSCLC患者带来了明显的临床获益[4]，免疫治疗逐渐成为了晚期NSCLC的研究热点。但是，大约只有不超过30%的患者对ICB产生应答[5]，甚至部分患者出现免疫超进展[6]，因此，探索理想的疗效预测标志物，从而筛选出优势人群是当前亟需解决的问题。

PD-L1是近些年研究和运用最多的疗效预测标志物，美国药品及食品管理局(Food and drug administration，FDA)已批准肿瘤细胞PD-L1的检测作为NSCLC接受PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂使用的伴随诊断或补充诊断，然而，因肿瘤异质性、检测手段未统一、PD-L1的动态变化等诸多因素导致PD-L1仍然不能成为理想的预测标志物[7]。 肿瘤突变负荷(Tumor mutational burden,TMB)是近几年新出现的免疫疗效预测标志物，研究表明，多种实体瘤接受PD-1抑制剂的有效率与TMB的表达呈线性关系[8]，而关于TMB与NSCLC接受ICB疗效的研究则是当前研究最受关注的一个方面，多个报道在近两年的AACR、ASCO及其WCLC大会上进行了交流。本文就TMB作为NSCLC免疫疗效预测标志物的研究进展作一综述。

1 TMB的定义及其作为ICB疗效预测标志物的理论依据

TMB通常指每百万碱基中被检测出的体细胞突变的基因数目，突变包括基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误[9]。目前，TMB预测肿瘤免疫疗效的机制尚不完全清楚。一般认为，TMB越高，产生新抗原的数量和频率会增加，即机体的免疫原性增强，使得肿瘤特异性T细胞能够对新抗原进行识别并最终产生免疫应答[10]。CTLA-4和PD-1是至今为止研究最成熟的两个检查点，CTLA-4通过与B7分子竞争性结合共刺激信号分子CD28从而抑制T细胞的活化，PD-1则主要通过与PD-L1结合导致T细胞耗竭，从而抑制效应T细胞的功能，导致肿瘤免疫逃逸。而ICB的作用机制则是阻断免疫抑制信号，恢复T细胞功能，增强其抗肿瘤效应[11]。根据Chen等[12]提出的肿瘤-免疫循环概念，肿瘤免疫反应是一个多环节过程，主要包括7个步骤。因此，TMB的高表达联合ICB在理论上可以促进肿瘤-免疫循环多步反应，最终增强抗肿瘤免疫效应。多项临床研究已证明TMB能够预测实体瘤接受免疫治疗的疗效，如黑色素瘤[13]、膀胱癌[14]、小细胞肺癌[15](Small cell lung cancer,SCLC)，关于TMB与NSCLC的研究更是层出不穷。

2 TMB对NSCLC免疫治疗的疗效预测作用

2.1肺癌突变谱与免疫疗效：非同义突变负荷 Rizvi等[16]用全外显子测序(Whole exsome sequenc-ing，WES)技术测定了34例接受Pembrolizumab 治疗的晚期NSCLC患者的基因组，以探索NSCLC患者突变谱对免疫疗效的影响。结果发现，在探索队列中(n=16)，获得持续临床获益(Durable clinical benefit，DCB)的患者中位非同义突变数明显高于无持续获益(No durable benefit，NDB)的患者(302 vs 148,P=0.02)；并且73%的高非同义突变负荷患者达到了DCB，而低非同义突变负荷的患者中仅13%的患者达到 DCB(P=0.04)。不仅如此，高非同义突变负荷患者的客观反应率(Objective response rate，ORR)和中位无进展生存期(Progression-free survival，PFS)均明显优于低非同义突变负荷患者(ORR：63% vs 0%，P=0.03；中位 PFS：14.5月 vs 3.7 月，P=0.01；HR：0.19，95%CI：0.05～0.70)，而在验证队列(n=18)也得到了同样的结果。

2.2初露头角：PD-L1预测失败到TMB登上舞台 CheckMate-026是一项旨在比较 Nivolumab与含铂双药化疗作为晚期NSCLC一线治疗疗效的临床试验[17]，该研究将PD-L1表达高于5%预设为标志物，结果却发现该亚组患者并未从免疫治疗中获益，事后的探索性分析新增加了PD-L1≥ 50%以及TMB两个指标，虽然PD-L1≥ 50%的肺癌患者仍未从免疫治疗中获益，但TMB却带来了不小的惊喜。研究者采用WES技术，将TMB≥ 243定义为高TMB，结果发现，在高TMB的患者中，Nivolumab组与化疗组的ORR为47% vs 28%,且Nivolumab组的PFS也优于化疗组(中位PFS：9.7月vs 5.8 月;HR：0.62;95%CI：0.38 ～1.00)。同时，TMB与PD-L1的表达无相关性(P=0.059)，但值得注意的是，在Nivolumab组中，高TMB且PD-L1≥ 50%的患者的ORR达到了75%，明显优于其他亚组。CheckMate-026研究第一次让肿瘤学者认为TMB可能是肺癌免疫治疗更具潜力的疗效标志物，并从此开启了TMB作为肺癌免疫疗效预测标志物的新篇章。

2.3再接再厉：纳入前瞻性研究预设因素与预测双ICB疗效 CheckMate-026研究结束后，另外两项前瞻性研究则让TMB的地位进一步提高。CheckMate-568是一项评价双ICB(Nivolumab 联合Ipilimumab)作为晚期NSCLC一线治疗的单臂Ⅱ期临床试验[18]，通过FoundationOne CDx平台检测患者肿瘤组织TMB的表达，经受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC)分析后发现，TMB≥ 10是筛选免疫治疗优势人群最合适的截取值，该部分患者的ORR为44%，明显高于其他亚组及所有纳入者的ORR。另一项探索双ICB治疗晚期NSCLC疗效的Ⅲ期临床试验(CheckMate-227)则将CheckMate-568的研究成果(TMB≥ 10)作为预设因素[19]。该研究分为三部分，第一部分将对比双免疫治疗与化疗组的PFS作为共同主要终点，结果首先于2018年美国癌症研究协会年会上公布,随后同步发表在《新英格兰杂志》上。结果显示，在高TMB(TMB≥ 10)患者中，双免疫治疗组的一年PFS率为42.6%，而化疗组的为13.2%，两组的中位PFS为7.2月vs 5.5月(HR：0.58，95%CI：0.41～0.81，P<0.001)，且双免疫治疗组的ORR也高于化疗组(45.3% vs 26.9%)。亚组分析结果显示，在高TMB患者中，无论其PD-L1的表达是否高于1%以及组织类型是鳞癌或非鳞癌，双免疫治疗组的临床获益均优于化疗组。CheckMate-227是迄今为止第一篇报道双免疫联合治疗用于晚期NSCLC的Ⅲ期临床研究，不仅再次证明了CheckMate-012 研究中双ICB对晚期NSCLC的有效性，同时也验证了CheckMate-568研究中TMB截取值(TMB≥ 10)的可靠性[20]。

几乎与此同时，同样由Hellmann等[10]完成的一项回顾性研究也得出了类似的结果。研究团队分析了CheckMate-012中的75例晚期NSCLC患者，采用WES检测其肿瘤组织TMB的表达情况，结果发现，在获得ORR和DCB中的患者TMB分别高于未获得缓解和NDB患者(273 vs 114,P=0.000 4;210 vs 113,P=0.007 1)。高TMB(TMB≥ 158)的患者中，ORR、DCB率、PFS均优于低TMB的患者(ORR:51% vs 13%,P=0.000 5;DCB:65%vs 34%,P=0.011;PFS:HR=0.41,P=0.0024)。此外，通过描绘ROC曲线发现TMB的表达与ORR及NDB具有明显的相关性。

3 TMB检测技术及样本来源

3.1肿瘤组织：WES vs NGS 上述研究中的TMB检测样本全部来自肿瘤组织，对于肿瘤组织样本，目前主要有两种检测技术，即WES和针对不同基因Panel的靶向第二代测序技术(Next generation sequencing，NGS)，较早的研究多采用WES技术[13,16]，但是WES技术昂贵且耗时[21]，导致其不能成为常规检测手段。相比WES，NGS检测技术更容易在临床上开展，CheckMate-227及CheckMate-568均采用了 FoundationOne CDx 平台下的NGS技术检测TMB。研究人员通过纪念斯隆凯特琳癌症研究中心的MSK-IMPACT NGS技术平台对10 000多例远处转移的癌症患者进行了基因测序，他们发现至少有9%的癌症相关突变是WES不能检测到的。不仅如此，MSK-IMPACT在1 597名患者(15%)中都检测到了融合基因，其中最常见的分别是TMPRSS2-ERG、EGFRvⅢ、EML4-ALK和EWSR1-FLI1，而这些也是WES不能检测到的[22]。

那么，WES及NGS检测出的TMB是否具有相关性呢？NGS检测出的TMB能够精确地预测免疫疗效吗？Rizvi等[23]回顾性地分析了240例经ICB治疗的晚期NSCLC患者，采用MSK-IMPACT NGS技术平台检测其TMB的表达，并对其中49例患者分别采用WES及NGS检测TMB，结果发现，两种检测技术测得的TMB具有高度相关性(P<0.001)，经NGS检测出的TMB在获得DCB及其ORR的患者中明显高于NDB及未获得临床缓解的患者(P=0.006 2、0.015 1)。进一步分析发现，对TMB进行四分位分层时，DCB比例及PFS也会随着TMB分层的增加而增加，TMB高于第50百分位数的患者DCB率及PFS均优于TMB低于第50百分位数的患者(DCB率,38.6% vs 25.1%;P= 0.009;PFS:HR=1.38，P=0.024)。该研究不仅证实了NGS可准确估算TMB，从而预测免疫治疗的优势人群，也证明了WES和NGS检测出的TMB呈高度相关性。2017年，美国FDA先后批准了Foundation Medicine公司的FoundationOne CDx以及MSK-IMPACT技术平台用于癌症基因检测(包括TMB)，因此NGS技术将会是今后检测肿瘤基因的主流技术。

3.2液体组织活检技术：基于血浆的TMB(bTMB)检测 NSCLC的治疗最能体现出精准医学的理念[24]，因此，患者在治疗前要检测多个分子标志物，如PD-L1、EGFR突变、ALK突变等。然而，约30%的NSCLC患者往往没有足够的组织标本用来检测所需要的分子标志物[25]，此外，肿瘤具有异质性，某一部位的肿瘤不能代表患者的整体情况[7]，再加上组织活检可能增加转移风险，所以，发展无创性的检测手段显得十分必要。液体活检技术是近年来发展颇为迅速的一种以循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)、循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)、循环肿瘤微RNA(microRNA，miRNA) 及肿瘤细胞来源的外泌体为检测物质的新技术，它主要的优点是操作简便、非侵入性、可重复性强[26]。

来自加州大学的Gandara等[25]首次证实了血浆中的TMB(bTMB)可重复测定，并且bTMB的表达与NSCLC患者接受ICB疗效相关。该研究收集了来自POPLAR[27]及OAK[28]两项研究的患者血液样本(POPLAR及OAK均是评价PD-L1抑制剂Atezolizumab治疗晚期NSCLC的临床试验)，采用FoundationOne CDx NGS平台检测其ctDNA中TMB的表达，研究团队首先将bTMB和组织TMB(tTMB)作了比较，结果发现二者呈正相关(Spearman相关系数=0.64，95%CI：0.56～0.71)。然后经过一系列的运算，将bTMB≥16作为POPLAR研究队列中的阈值，并通过OAK研究队列进行验证，分析后发现，bTMB≥ 16 的患者能从免疫治疗中获得更好的预后，Atezolizumab组的PFS和OS均优于多西他赛化疗组(PFS：HR= 0.65，95%CI:0.47-0.92，P=0.013；中位OS：13.5月 vs 6.8月)。与CheckMate 568及CheckMate 227类似，bTMB预测作用与PD-L1的表达无关。

对于肿瘤组织不可用的NSCLC患者，bTMB的检测是一种非常好的替代手段。关于bTMB的第一个前瞻性研究BFAST(NCT03178552)也正在开展，最终结果值得期待。

4 TMB与其他分子之间的联系

PD-L1是当前研究比较成熟的分子，关于TMB与PD-L1的关系也是研究者们比较感兴趣的一个部分，然而，多个研究表明两者的表达无相关性[17,19,25]，但对PD-L1及TMB一起分析时，高TMB且PD-L1阳性的患者免疫应答率明显高于其他组合[23,25]。Rizvi等[16]发现在获得DCB的高TMB患者中产生了POLD1、POLE、MSH2基因缺失突变，另外，他们还发现TMB与新抗原负荷具有相关性(P<0.000 1)，而新抗原负荷的表达也能预测免疫疗效。在Hellmann等[10]的研究中，TP53基因突变富集在免疫治疗应答者中(P=0.048)，且TP53突变与TMB的增加高度相关，而在无应答的患者中发现了STK11及PTEN基因突变。针对EGFR基因突变的靶向治疗是NSCLC治疗中非常重要的部分，一项Meta分析发现，EGFR驱动基因阳性的NSCLC患者不能从免疫治疗中获益，其中的机制之一就是EGFR阳性患者整体低表达TMB[29，30]。从上述研究可以看出，TMB的表达与其他分子之间存在一定的关联，但其中的机制和可能蕴藏的信号通路尚未阐明，今后需要大样本量的基因分析进一步研究。

5 小结与展望

TMB作为近年来NSCLC免疫疗效预测标志物的“新秀”，多个研究表明其能够较准确地预测免疫疗效，检测技术从WES到靶向NGS的出现，检测样本由肿瘤组织到血液的过渡，TMB的测定逐渐变得可行和方便，有希望成为今后NSCLC免疫治疗的常规检测分子。但它仍然是不完美的，首先，TMB的检测手段目前尚未统一，其截取值也没有一个较精确的范围。其次，对于肿瘤组织来源的TMB，由于肿瘤存在异质性，某个病灶的TMB不能反映整体的情况；再者，某些治疗如化疗和放疗会对肿瘤微环境产生变化，导致患者治疗前后的TMB表达情况也不一致。另外，对于bTMB的检测，其计算方法也有值得商榷和继续探讨的地方[25]。最后，由于机体的免疫系统是一个非常复杂的体系，仅仅靠某一个分子标志物进行精确地预测疗效是不大可能的，今后可以结合其他分子标志物(如免疫微环境中的CD8+T细胞等)甚至临床预后因素，建立一个综合预测模型，为晚期NSCLC患者带来更有效和个体化的免疫治疗。