猴头菌粉对小鼠急性酒精性胃损伤的预防作用

毛湘君芝 陆震鸣 耿燕 许泓瑜 袁峰 赵伏梅 徐国华 史劲松 许正宏，3

（1江南大学药学院，江苏无锡214122；2江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122；3江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；4江苏神华药业有限公司，江苏淮安211600）

猴头菌（Hericium erinaceus），又称猴头菇，隶属于担子菌门、猴头菌科、猴头菌属，是著名的药食两用真菌。根据《本草纲目》和《中华本草》记载，猴头菌性平、味甘，有“利五脏、助消化”的功能[1-2]。猴头菌脂肪含量低，富含蛋白质、多糖和膳食纤维。它也是必需氨基酸、酚类化合物和微量营养素的良好来源[3]。现代研究表明，猴头菌的子实体、菌丝体及其提取物有多种生物学活性，如保护胃肠道、抗肿瘤、降糖降压、保肝、抗衰老、抗菌和神经保护作用[4]。目前临床上主要用于治疗胃和十二指肠溃疡、慢性胃炎和消化道肿瘤等[5-6]。

袋料栽培是目前人工栽培猴头菌子实体最常用的方法，但这种方法生产周期长、费用较高、且可能存在潮次不稳定的现象。而将液态深层发酵技术应用于猴头菌的生产，能缩短生产周期、降低成本、提高产品稳定性，并且易于实现工厂化生产。目前，关于猴头菌子实体及其提取物的药效评价相关研究越来越多，但对液态深层发酵生产猴头菌丝粉的护胃功能研究较少。笔者旨在探讨猴头菌粉对小鼠急性酒精性胃损伤的预防作用，为猴头菌粉的进一步开发利用提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

猴头菌粉由江苏神华药业有限公司采用深层液态发酵法生产，符合国家药品标准[7]；西咪替丁购于青岛捷世康生物科技有限公司。

试验动物：6周龄雄性C57BL/6小鼠，18～22 g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。

1.2 试剂与仪器设备

苏木素伊红染色试剂盒（碧云天生物技术公司）；丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程有限公司）；M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）；TRIzol试剂（美国Roche公司）；SYBR Select Master Mix（美国Thermo公司）；微量pH计（Mettler Toledo公司）；RM2245半自动轮转切片机（德国Leica公司）；荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 动物模型的建立和样品的采集

雄性C57BL/6小鼠48只，随机分为空白组、模型组、阳性组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，共6组，每组8只。空白组、模型组小鼠灌胃0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液；阳性组药物为西咪替丁，给药剂量为100 mg/kg；猴头菌粉低、中、高剂量组分别为 125 mg/kg、250 mg/kg、500 mg/kg，所有药物均溶于0.5%CMC-Na溶液中。每日灌胃给药1次，连续6 d，第6天给药后禁食24 h，不禁水。第7天除空白组外，其他各组给药90 min后用无水乙醇0.1 mL/10 g灌胃，4 h后处死，取胃组织用于后续试验。

1.4 胃液pH的测定

用微量pH计测量小鼠胃液pH。

1.5 胃黏膜损伤情况的肉眼观察

将小鼠全胃沿胃大弯剪开，用冷生理盐水漂洗内容物。将胃组织摊平，胃内表面朝上，对胃黏膜的损伤情况进行肉眼观察，评价胃黏膜完整性及出血情况。

1.6 胃黏膜组织病理学检查

将小鼠胃组织置于10%甲醛溶液中固定，脱水，石蜡包埋，将其切成4µm薄片。用苏木素伊红染色试剂盒染色，中性树胶封片，然后在显微镜下观察。根据胃黏膜细胞脱落（0～3分）、出血（0～4分）、水肿（0～4分）、炎细胞浸润（0～3分）情况进行评分[8]。

1.7 胃组织中丙二醛（MDA）的测定

取小鼠胃组织，用丙二醛（MDA）测定试剂盒检测MDA含量。具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.8 胃组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）mRNA表达量的测定

用TRIzol试剂提取小鼠胃组织RNA，用cDNA合成试剂盒将RNA反转录成cDNA。使用SYBR Mix试剂和特异性引物进行qRT-PCR。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

引物序列如下：TNF-α上游引物5′-GACCCCTTTACTCTGACCCC-3′，下游引物5′-AGGCTCCAGTGAATTCGGAA-3′；IL-1β上游引物5′-ACTCATTGTGGCTGTGGAGA-3′，下游引物5′-TTGTTCATCTCGGAGCCTGT-3′；GAPDH 上游引物5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

qRT-PCR反应体系：上游引物（5µmol/L），0.425µL；下游引物（5µmol/L），0.425µL；cDNA，1.25 µL；SYBR Green Mix，8.5 µL；RNase-free H2O，6.4 µL。反应条件为：95°C预变性，10 min，95°C变性，15 s，60°C退火，30 s，60°C 延伸，30 s，共 40个循环。

1.9 统计分析

用GraphPad Prism软件进行数据分析，试验结果用平均值±标准误（SEM）表示，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 小鼠胃黏膜的肉眼观察

小鼠胃壁内部胃黏膜如图1所示。正常组小鼠胃黏膜光泽红润，完整无损伤（图1a）。乙醇灌胃后模型组小鼠胃黏膜表面有明显出血、损伤溃烂（图1b）。猴头菌粉低、中、高剂量组以及阳性组，胃黏膜有部分出血，但损伤程度减轻（图1c-f）。

图1 猴头菌粉对小鼠胃黏膜损伤程度的影响

2.2 小鼠胃黏膜的组织病理学观察

图2 猴头菌粉对小鼠胃黏膜组织病理学变化的影响

表1 胃黏膜组织病理学变化各项得分

正常组小鼠胃黏膜各层结构完整清晰，细胞形态完整，腺体排列规则，未见组织缺损、出血、炎症等异常病变（图2a）。模型组小鼠黏膜层细胞弥散性坏死脱落情况严重，黏膜层中可见大量红细胞，细胞肿大、排列松散，有炎细胞浸润（图2b）。阳性组小鼠部分黏膜上皮细胞坏死脱落，部分细胞排列松散，黏膜层中有少量红细胞，有少量炎细胞浸润（图2c）。猴头菌粉低、中、高剂量组小鼠胃黏膜形态与模型组相比都有不同程度改善（图2d-f）。对小鼠胃黏膜细胞脱落、出血、水肿、炎细胞浸润情况分别进行评分（表1），分数越高表明损伤越严重。猴头菌粉低、中、高剂量组胃黏膜组织病理学变化各项得分之和分别为8.00±0.13、7.75±0.17、5.50±0.09，与模型组（9.63±0.06）相比分别降低了16.93%、19.52%、42.89%（图3）。其中高剂量组差异最显著（P＜0.001），胃黏膜形态更接近正常组。

图3 胃黏膜组织病理学变化评分

图4 猴头菌粉对小鼠胃液pH的影响

2.3 小鼠胃液pH

如图4，模型组小鼠胃液pH为6.33±0.06，与正常组有显著性差异（P＜0.001），表明乙醇会对胃液pH产生影响。而阳性组、猴头菌粉低中高剂量组小鼠胃液pH为6.79±0.03、6.67±0.04、6.76±0.06、6.88±0.03，与模型组没有显著性差异（P＞0.05）。

2.4 小鼠胃组织中MDA含量

模型组小鼠胃组织中MDA含量达到（5.46±0.10）nmol/mg，是正常组的2.45倍。表明酒精能使小鼠胃组织中MDA含量大幅度增加，引起组织损伤。而阳性组、猴头菌粉低、中、高剂量组小鼠胃组织中MDA含量分别为（4.55±0.08）nmol/mg、（4.97±0.15）nmol/mg、（4.77±0.09）nmol/mg、（4.53±0.13）nmol/mg，比模型组略少，但没有显著性差异（P＞0.05）（图5）。表明猴头菌粉对酒精引起的MDA含量增加有一定的缓解作用。

图5 猴头菌粉对小鼠胃组织中MDA的影响

2.5 小鼠胃组织TNF-α和IL-1β mRNA的表达量

模型组、阳性组、猴头菌粉低、中、高剂量组小鼠胃组织中，TNF-α mRNA表达量分别是正常组的11.6、5.6、5.9、5.3和4.3倍（图6a、b）。与模型组相比，猴头菌粉低、中、高剂量小鼠胃组织中TNF-α mRNA表达量分别下降了49.0%、54.6%、63.1%，差异显著（P＜0.05）。模型组、阳性组、猴头菌粉低、中、高剂量组小鼠胃组织中，IL-1β mRNA表达量分别是正常组的6.8、3.0、4.9、3.8和3.5倍。与模型组相比，猴头菌粉低、中、高剂量小鼠胃组织中IL-1β mRNA表达量分别下降了27.8%、43.9%、48.3%。

图6 猴头菌粉对小鼠胃组织TNF-α和IL-1β mRNA表达量的影响

3 小结与讨论

采用无水乙醇灌胃导致的小鼠急性胃损伤模型，探究猴头发酵菌粉对胃黏膜的保护作用。该模型制作简便、成模速度快，其损伤特点、愈合过程与人胃黏膜损伤类似[9]。

酒精引起的胃损伤常伴有氧化应激及炎症反应。丙二醛是由多不饱和脂肪酸的脂质过氧化产生的，是氧化应激的标志物。因此，脂质过氧化程度及机体的氧化应激水平可以通过组织中丙二醛的含量进行评估。此外，研究表明，酒精会激活机体的免疫系统从而影响促炎因子的水平，包括TNF-α和IL-1β[10]。TNF-α作为一种具有多种功能的重要细胞因子，与其他炎症因子（如IL-1β和IL-6）的活化密切相关，参与炎性疾病的发展[11]。而IL-1β和IL-6的激活会进一步促进TNF-α的表达，加剧炎症反应。TNF-α是致炎最强的因子之一，因此常作为判断炎症程度的指标。

以不同剂量的猴头菌粉连续灌胃小鼠6 d后，观察乙醇灌胃后小鼠胃黏膜的损伤情况。检测小鼠胃液pH、胃组织MDA含量、TNF-α和IL-1β mRNA的表达情况，结合胃组织病理学检查，评价猴头菌粉对急性酒精性胃损伤的保护作用，初步探究猴头菌粉保护胃黏膜的机制。结果表明，模型组小鼠胃黏膜可见明显出血、溃烂、细胞坏死脱落情况，胃液pH明显升高，胃组织MDA含量显著增加，胃组织中TNF-α和IL-1β mRNA表达量明显增加。灌胃猴头菌粉能显著改善小鼠胃黏膜中出血、溃烂、细胞坏死脱落情况，胃组织MDA含量略有下降，但对酒精引起的pH升高没有显著影响。而小鼠胃组织中TNF-α和IL-1β mRNA含量明显少于模型组，提示猴头菌粉可能通过抑制炎症因子TNF-α和IL-1β的表达，从而减轻炎症反应，减少酒精对胃黏膜的损伤，达到保护胃黏膜的效果。