真姬菇不同生长时期胞外酶活性变化研究

宋利茹 窦宏强 席亚丽 梁倩倩 魏生龙 *

（1河西学院厅市共建甘肃省食用菌遗传育种重点实验室，甘肃张掖734000；2河西学院甘肃省应用真菌工程实验室，甘肃张掖734000）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）又名斑玉蕈、蟹味菇、玉蕈、海鲜菇等[1]隶属真菌界（Fungi），担子菌门（Basidiomycota），伞菌纲（Agaricomycetes），伞菌目（Agaricales），离褶伞科，玉蕈属（Hpysizygus），是北温带一种珍稀药食两用菌[2]。

真姬菇虽然已成为我国商品化栽培的品种之一，但由于其在栽培过程中的生产周期较长（120～140 d）[3]，限制了真姬菇工业化生产的进度，同时也导致生产成本较高。在食用菌生长发育过程中，胞外酶将培养料的大分子裂解成能使菌丝和子实体利用的小分子物质，从而为食用菌的生长发育提供所需的营养物质，因此，胞外酶在食用菌的整个生长发育过程都起着非常重要的作用[4-5]。笔者对真姬菇在菌丝长至菌袋的1/4、菌袋1/2等共8个生长发育时期的胞外酶活性进行测定，以期找出真姬菇在不同生长发育时期胞外酶活性变化规律，为揭示真姬菇基质利用机理提供理论参考，从而为工厂化生产缩短真姬菇生长周期提供借鉴。现将试验结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

采用真姬菇3001，由甘肃省应用真菌工程实验室提供。

1.2 培养基

液体培养基和PDA培养基参照参考文献[6]的方法制备。

1.3 仪器设备

不锈钢立式压力灭菌锅；恒温摇床THZ-92A，上海浦东物理光学仪器厂；电子天平，BS223S，Sartorius；生化培养箱；超净工作台SW-CJ-IFD，苏州净化设备有限公司；电磁炉。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种活化

从冰箱中取出供试菌株，在无菌条件下，接种于75 mL的PDA平板中央，封口，25℃恒温培养备用[6]。

1.4.2 拌料及装袋灭菌

真姬菇栽培料配方为：棉籽壳49%，木屑30%，麸皮15%，玉米面5%，石膏粉1%。选用17 cm×33 cm的聚丙烯塑料袋装料，每袋装湿料0.6 kg，于121℃下高压灭菌2 h，于冷却室冷却，待料温低于25℃后于无菌条件下接种，接种后将栽培袋移入培养室中。培养条件为温度25℃，空气相对湿度65%～75%，出菇条件为温度15℃，空气相对湿度95%，光照400 lx。

1.4.3 样品采集

观察记录真姬菇生长发育，于以下8个不同生长发育时期进行取样：①菌丝长至菌袋的1/4，②菌丝长至菌袋1/2，③菌丝长至菌袋3/4，④菌丝满袋，⑤原基形成，⑥原基形成后7 d，⑦子实体成熟，⑧子实体采后3 d。随机选取各生长阶段菌袋3袋，每袋取样20 g，混匀，备用。

1.4.4 酶液制备

粗酶液提取参照参考文献[7]的方法。取混匀后的样品5 g加入20 mL去离子双蒸水，40℃浸提2 h，过滤、定容至 25 mL，4℃、10 000 r/min离心10 min，取上清（上清液即为粗酶液），低温保存备用。

1.4.5 各种酶活性测定

羧甲基纤维素酶活性测定参照参考文献[8]；滤纸纤维素酶活性测定参照参考文献[8]；淀粉酶活性测定参照参考文献[9]；漆酶活性测定参照参考文献[10]；β-葡萄糖苷酶活性测定参照参考文献[9]；愈创木酚酶活性测定参照参考文献[11]。

1.5 数据处理

用Excel 2010软件对数据进行统计、作图，用SPSS19.0统计软件进行处理[12]。

2 结果与分析

2.1 木质素降解酶

2.1.1 漆酶活性变化

由图1可以看出真姬菇在原基形成和子实体采后3 d时漆酶活性最高，且极显著高于其它各生长发育时期。

2.1.2 愈创木酚酶活性变化

愈创木酚酶同漆酶一样可以衡量真姬菇对木质素的降解能力。由图2可以看出，愈创木酚酶活性在成熟期以前没有显著性差异；在采后3 d愈创木酚酶活性达到最大值。愈创木酚酶在生殖生长阶段活性显著高于营养生长阶段，说明真姬菇对木质素的利用主要集中在子实体生长阶段。

2.2 纤维素降解酶

2.2.1 羧甲基纤维素酶活性变化

从图3可以看出，供试菌株第8个生长阶段即子实体采后3 d纤维素酶活性最高，可达到14.36 U，且显著高于其它生长发育时期；其次子实体成熟期纤维素酶活性也显著高于其它时期；而其中以原基形成后7 d的纤维素酶活性最低。表明真姬菇在子实体成熟和采后3 d出现了较高纤维素酶活性。纤维素酶与真姬菇子实体生长发育相关，但在真姬菇子实体形成阶段纤维素酶活性均较低，可能导致真姬菇对栽培基质的利用率不高。

2.2.2 滤纸纤维素酶活性变化

由图4可以看出，真姬菇在菌丝长至菌袋1/4时滤纸纤维素酶活性最高为3.62 U，且随着生长发育滤纸纤维素酶活性降低，在菌丝长至菌袋1/2及原基形成后7 d时最低，并且极显著低于其它各生长发育时期。

图1 漆酶活性

图2 愈创木酚酶活性

图3 羧甲基纤维素酶活性

图4 滤纸纤维素酶活性

图5 β-葡萄糖苷酶活性

图6 淀粉酶活性

2.2.3 β-葡萄糖苷酶活性变化

由图5可以看出，在真姬菇整个生长阶段，β-葡萄糖苷酶呈现先上升后下降的趋势。并且在原基形成阶段达到最高值为14.2 U，且极显著高于其它生长发育时期；而以菌丝长至菌袋3/4时最低。

2.3 淀粉酶活性变化

由图6看出，随着真姬菇生长发育淀粉酶活性升高，且在子实体采后3 d纤维素酶活性最高，可达到5.87 U，但与子实体成熟期差异不显著，与其它发育阶段差异极显著。淀粉酶活性以菌丝长至菌袋1/2最低为0.584 U。

3 小结与讨论

胞外酶活性的变化反映食用菌对培养料利用情况，一直以来都是研究的热点。

试验结果表明，滤纸纤维素酶在菌丝长至菌袋1/4时活性最高，这可能与滤纸纤维素酶是最初对纤维素起作用的酶有关，而β-葡萄糖苷酶在营养生长阶段呈逐渐上升的趋势，且在原基形成期达到最大值，随后逐渐下降；羧甲基纤维素酶呈逐渐上升的趋势，且在采后3 d达到最大值，这三种酶的峰值交替出现，可能与纤维素在基质中的结构形式有关，同时也说明这三种酶分别在真姬菇不同生长发育时期起关键作用。

试验表明，漆酶的活性远高于愈创木酚酶的活性，说明漆酶在真姬菇降解木质素过程中起主要作用。漆酶和愈创木酚酶均在采收后期出现峰值，说明在这一过程中大量木质素被降解，使得纤维素被暴露，这也可能与羧甲基纤维素酶在采后后期出现峰值有关。漆酶活性在采后3 d与原基形成期差异不显著，说明漆酶与真姬菇的原基形成有关，这一结果与袁胜东等[8]的研究结果一致，在猴头菇、虎皮香菇[13]、白灵菇[14]及香菇[15]等的研究中也发现在原基形成期漆酶活性达到最大值，但关于漆酶与原基形成的机理尚不清楚，可以作为今后研究方向。试验发现除了漆酶在原基形成期有最高活性外，β-葡萄糖苷酶在原基形成期也达到最高值，但β-葡萄糖苷酶是否与原基形成有关还需进一步验证。

淀粉酶的活性也随着真姬菇生长发育呈增加趋势，且在成熟期及采后3 d达到最高值，说明淀粉酶可能与子实体成熟密切相关，因此，可以在真姬菇的栽培基质中适当加入淀粉类物质，可能有助于提高真姬菇的产量。

综上所述，真姬菇培养料中降解木质素的漆酶和愈创木酚酶在菌丝生长阶段活性均较低，可能导致木质素降解缓慢，而木质素又是纤维素和半纤维素被降解的前提，因此，真姬菇菌丝生长阶段由于养分供应不充足而生长缓慢，这也可能是真姬菇生长周期较长的主要原因。可以考虑继续优化真姬菇栽培料配方，以期找到能缩短栽培周期的最优配方。其次，漆酶可能与真姬菇原基形成有关，可以考虑通过调控漆酶的活性使真姬菇较早由生殖生长期转入营养生长期，以缩短栽培周期。