P2X7受体参与疼痛调节机制的研究进展

陆 帆， 傅燕璐， 高银平，刘荣君， 陈晓薇

(宁波大学医学院, 浙江省病理生理学技术研究重点实验室, 宁波行为学重点实验室, 浙江 宁波 315211)

疼痛是一种不舒服的感觉和情绪体验，疼痛是病患寻求医疗帮助最主要的原因之一，疼痛给个人、家庭以及社会带来巨大的经济负担。疼痛的发病机制较为复杂，探究疼痛发病的分子机制，对有效镇痛药物的发现有指导意义。目前临床上疼痛缓解手段有限，因此，新型镇痛手段的发现将给整个社会带来巨大福祉。

P2X7受体是配体门控离子型嘌呤能P2X受体的一个亚型, 最早由Keller发现，Rassendren等人首次从大鼠cDNA文库中克隆出P2X7受体的全长cDNAs。现阶段研究表明[1], P2X7受体能通过多种外周及中枢机制参与疼痛的产生和维持，以及吗啡耐受的过程。本文总结近年来P2X7受体在疼痛相关的临床及基础研究中的作用，并深入P2X7受体参与疼痛的调节过程的可能机制。

1 P2X7受体

1.1 P2X7受体的结构与分布P2X7受体基因位于染色体12q24.31位点附近，含有13个外显子，编码595个氨基酸组成的多肽链。P2X7受体与P2X受体其他亚型有40%左右的同源性，与P2X4受体同源性达48.6%。P2X7受体氨基端N-和羧基端C-在均在胞内。P2X7受体N-端有395个高度保守的氨基酸序列，该末端与P2X7受体作为离子通道的选择性以及受体与细胞外调蛋白激酶的相互作用相关。P2X7受体C-端较其他P2X受体长，与其他受体无同源性，该末端参与P2X7受体大部分功能，如透化细胞膜。P2X7受体具有两个跨膜结构域，TM1区和TM2区。P2X7受体TM2区存在β-折叠，被认为与P2X7受体孔隙形成相关。

P2X7受体mRNA广泛分布于多种组织，如胸腺、脾脏、肺、脊髓和大脑，主要表达于造血谱系细胞，包括单核细胞、巨噬细胞和小胶质细胞等。过去关于神经元中是否有P2X7受体表达存在争议，近年来得益于更成熟的原位杂交技术，研究人员发现，大鼠大脑不同区域均存在P2X7受体mRNA。电生理学和药理学技术发现，P2X7受体在神经元中的表达并且在突触传递中的发挥作用。

1.2 P2X7 受体激动剂和拮抗剂P2X7受体受ATP及其衍生物激活。其中，BzATP的激动效能最高，而MeSATP、 α-meATP和β-meATP也可以部分激活P2X7受体。P2X7受体拮抗剂种类较多，包括二价阳离子(如Ca2+、Mg2+和Cu2+)、有机阳离子calmidazolium、P2X7受体单克隆抗体、天然化学药物如白屈菜红碱和新型化合物等。近年来，合成的新型分子以其高竞争性及高特异性被基础研究者广泛使用。目前常用的P2X7受体拮抗剂有以下几种，(1) P2受体通用拮抗剂：P2受体通用拮抗剂磷酸吡哆醛 (pyridoxal 5-phosphatemonohydrate，PPADS) 和苏拉明及其类似物NF279可部分拮抗P2X7受体。亮蓝G (brilliant blue G，BBG) 及其类似物对P2X7受体具有较高的拮抗效能。高浓度氧化ATP (oxidized ATP，oxATP) 长时间施用不可逆拮抗P2X7受体；(2) KN-62：喹啉衍生物KN-62对人P2X7受体有很好的抑制效果，但对大鼠P2X7受体离子电流影响不大；(3) 氰基胍衍生物：Abbott Laboratories公司合成的氰基胍类衍生物被证明是具有较高拮抗效能的P2X7受体拮抗剂，如A-740003和A-438079。18～40 nmol·L-1的A-740003即可抑制人和大鼠的P2X7受体。二代氰基胍衍生物A-438079以更好的选择性和更高的亲和力拮抗人和大鼠P2X7受体；(4) GSK类化合物：Glaxo公司开发的GSK类化合物在表达人重组P2X7R的HEK293细胞中对P2X7R具有拮抗作用。

2 P2X7受体与疼痛

根据持续时间，疼痛可以分为急性痛和慢性痛。急性疼痛是指短期存在的疼痛，慢性痛一般指超过正常愈合时间3个月的疼痛。当机体受到伤害(如机械、热和化学)刺激，疼痛信号沿着A-δ/C纤维从外周传输到脊髓，介导感觉神经元释放ATP，提高背根神经节 (dorsal root ganglion，DRG) 神经元兴奋性。ATP激活P2X受体刺激细胞兴奋性，增加兴奋性氨基酸的释放，引发一系列伤害性反应，最终可导致细胞凋亡。一些P2受体通用拮抗剂如PPADS和苏拉明在动物模型上被证明缓解多种类型疼痛。随着特异性更高的拮抗剂以及抗体的开发，更多的研究表明，P2X3受体、P2X4受体和P2X7受体均不同程度参与调控神经元的兴奋性，在疼痛信号传导中发挥作用。

P2X7基因(P2rX7)显示高频率的单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism，SNP)。Sorge等[2]利用全基因组连锁分析，发现携带P451L突变的小鼠比表达P2rX7野生型等位基因的小鼠不容易出现痛觉过敏，提出编码序列的突变会影响疼痛敏感性。Ursu等[3]的研究发现，P2rX7基因中一些SNP与糖尿病神经性疼痛患者群体中的疼痛敏感性相关，尤其是SNP (rs208294) 和SNP (rs1718119)[3]。东京都医科大学的研究人员招募了355名受试患者，通过对P2rX7受体基因SNP与疼痛敏感性以及麻醉药物芬太尼的镇痛作用联合分析，发现天然的冷痛敏感性和芬太尼的镇痛作用与P2rX7中的SNP (rs1718125) 和其单倍型高度相关。Kambur等[4]发现P2rX7SNP (rs7958311) 与接受乳腺癌手术的患者的疼痛强度和耐受性相关。P2rX7SNP与疼痛敏感性的关系暗示了P2X7受体在疼痛中的作用。

2.1 P2X7受体与炎性疼痛炎性痛是指由外周组织损伤而引起炎症反应时所发生的疼痛。疼痛研究中，常用的炎性痛模型主要有完全弗氏佐剂 (complete freund’s adjuvant，CFA)模型、角叉菜胶炎症模型和福尔马林致痛模型。Chessell等[5]发现，在P2X7R基因敲除鼠中，足底给与CFA不能引起小鼠的痛觉过敏。Fulgenzi及其同事也发现类似的现象：P2X7R基因的缺失使得胶原蛋白诱导关节炎模型小鼠以及乙酸诱导的内脏痛模型小鼠没有表现出痛觉过敏现象[6]。

关节注射CFA明显降低大鼠伤害感受阈值，增加大鼠后爪神经纤维和血管中P2X7受体的表达，而P2X7受体拮抗剂A-740003施用显著降低CFA诱导的关节炎模型鼠的炎性疼痛，减少发炎部位P2X7受体的表达。足底注射福尔马林1 h内会触发小鼠两个阶段的疼痛行为，第一阶段为福尔马林注射后5 min内，第二阶段为福尔马林注射后20～40 min，研究表明福尔马林介导的中枢敏化发生在第二阶段。A740003和A-438079减少福尔马林疼痛模型第二阶段的自发伤害性行为，暗示P2X7受体参与疼痛的中枢敏化。除了福尔马林，A438079还缓解由CFA、蜂毒和角叉菜胶等致炎物质诱导的疼痛行为。Itoh等[7]发现，BBG有效缓解芥子油引起的炎性疼痛。GSK314181A的施用剂量依赖性降低角叉菜胶诱导的机械超敏反应，并减轻足爪肿胀[8]。与A438079类似，P2X7受体拮抗剂 oxATP对CFA、角叉菜胶、胶原蛋白、脂多糖和芥子油等诱导的炎性疼痛有较好的抑制效果[6,9,10]。

Clark等[10]认为P2X7受体是通过靶向小胶质细胞释放IL-1β在疼痛中发挥作用，而多种P2X7受体拮抗剂(A-740003、A-438079和oxATP)的施用均能抑制IL-1β的释放。有意思的是，鞘内注射A740003或者PANX1抑制剂甘珀酸抑制了足底注射辣椒素诱导的急性伤害感受[11]。最新研究表明，碘乙酸单钠(MIA)诱导的关节炎大鼠模型模型中，脊髓小胶质细胞中P2X7受体上调，P2X7受体驱动PANX1通道激活，介导促炎细胞因子IL-1β的释放，拮抗或敲除脊髓小胶质细胞P2X7受体或者阻断PANX1均有缓解MIA诱导的机械性痛觉过敏[12]。

2.2 P2X7受体与神经病理痛神经病理性痛是指外周神经病变所致的疼痛，目前常用的神经病理痛模型有：坐骨神经慢性压迫模型 (chronic constriction injury，CCI)，坐骨神经分支选择损伤模型 (spared nerve injury，SNI)，坐骨神经半结扎模型 (partial sciatic nerve injury，PNL) 和脊神经选择结扎模型(spinal nerve ligation，SNL)。Chessell 和Fulgenzi的研究发现SNI和SNL无法引起P2X7受体缺失鼠痛觉过敏[5, 6]。PNL手术后，P2X7受体缺陷型小鼠出现痛觉过敏，但该组小鼠痛阈较野生型小鼠高，说明P2X7受体可能部分参与PNL介导的神经病理痛。

P2X7受体拮抗剂A-740003减轻了CCI和长春新碱诱导的神经病诱痛，抑制IL-1β的释放。A-438079减弱了SNL、CCI和长春新碱引发的神经性疼痛，并且，A-438079的施用还降低了由SNL诱发的脊髓神经元的异常自发放电[13]。鞘内注射A438079，还减轻三叉神经横断后小鼠的痛觉过敏并逆转TNF-α表达水平的增加。与炎性疼痛的结果类似，oxATP的施用缓解了SNL后小鼠的痛觉过敏[6]。亚急性BBG治疗完全阻断了硝酸甘油诱导的偏头痛模型鼠的痛觉过敏。

小胶质细胞广泛分布于中枢神经系统中，以往研究认为，小胶质细胞活化输出疼痛信号，从而参与神经病理痛。当出现神经损伤时，脊髓背角小胶质细胞中P2X7受体表达增加。通过抑制脊髓背角小胶质细胞中的P2X7受体有效抑制小胶质细胞的活化。

2.3 P2X7受体与癌痛疼痛是癌症患者的常见症状，据统计，59%的癌症患者会感到疼痛，其中超过三分之一的患者为中度甚至重度疼痛，然而目前50%～80%的癌症疼痛没有得到有效的控制。

Zhao等[14]认为P2X7受体在癌症疼痛中发挥作用，他们的研究发现，P2X7受体缺失的骨癌模型小鼠没有出现骨癌诱导的疼痛行为。Huang等[15]用BBG有效缓解了骨癌大鼠模型中的疼痛感。Falk等[16]用A839977缓解骨癌痛模型动物早期和晚期疼痛行为。Yang等[17]发现，骨癌模型大鼠模型脊髓小胶质细胞P2X7受体，磷酸化p38 MAPK和IL-18水平均增加，而抑制脊髓P2X7R/p38/IL-18通路减少了骨癌晚期的疼痛行为。阻断P2X7受体不止可以减少癌症疼痛，还可以有效抑制肿瘤生长。P2X7受体拮抗剂AZ-10606120引起明显的肿瘤消退，oxATP显著抑制B16黑色素瘤小鼠中的肿瘤生长。然而也有研究表明BBG或P2X7R shRNA显著促进肿瘤生长。因此，P2X7受体很可能参与癌症介导的疼痛调制过程，但是P2X7受体在肿瘤生长中的作用还需进一步研究。

2.4 P2X7受体与吗啡耐受吗啡是临床上使用最广泛的强效镇痛剂之一。然而持续给予吗啡后，患者对吗啡产生耐受，具体表现为吗啡的镇痛效果减弱，先前的吗啡剂量不足以抑制疼痛。

多项研究表明，P2X7受体参与吗啡耐受的形成。慢性吗啡暴露后大鼠脊髓小胶质细胞中P2X7 受体表达上调，鞘内给与BBG可阻断P2X7 受体表达的增加并一定程度缓解吗啡耐受的形成，初步表明P2X7 受体参与了吗啡耐受的形成。Xiao等[18]靶向腹外侧中脑导水管周围灰质 (ventrolateral periaqueductal grey matter，vlPAG) 注射P2X7受体拮抗剂显著减轻吗啡耐受的发展。另外，Cao等[19]靶向vlPAG中P2X7受体的寡脱氧核苷酸也有类似的作用，值得注意的是，在该研究中，P2X7受体是通过激活D-丝氨酸发挥作用。另外，P2X7受体羧基端的酪氨酸Y382-384在P2X7受体参与吗啡耐受中发挥关键作用，靶向作用于该位点可减弱吗啡耐受。

3 P2X7受体参与疼痛的调制的可能机制探讨

3.1 P2X7受体激活PANX1Pannexins蛋白与间隙连接蛋白innexins家族显示出一定的同源性。Pannexins被认为是连接细胞内和细胞外的跨膜通道，目前鉴定出3种pannexin蛋白，PANX1、PANX2和PANX3，其中PANX1表达最为广泛。最初Sylvia提供有力的证据表明ATP的释放由P2X7受体介导，而通道蛋白拮抗剂(carbenoxolone、heptanol)抑制了Bz-ATP诱导的细胞对大分子染料Yo-pro的摄取。Lecovei等[20]进一步证明PANX1参与P2X7受体的功能，并认为P2X7受体不是作为一个独立的通道，而是一个通道复合物发挥作用。P2X7R-PANX1复合物的下调导致骨细胞对机械负荷不敏感，增加骨骼损害的风险。P2X7R-PANX1复合物可能通过细胞内Ca2+释放增加毛果芸香碱诱导的癫痫发作的易感性，暗示复合物可能在体内作为M1受体介导的癫痫发作活动中的负调节剂。另外，这种复合物可能参与先天免疫的早期阶段。Pelegrin等[21]观察到，LPS介导人和小鼠巨噬细胞中P2X7R-PANX1复合物的形成，siRNA和药理学手段抑制PANX1功能影响IL-1β的释放，但P2X7R-PANX1复合物在疼痛中的作用尚不明确。

3.2 P2X7受体介导炎症反应病理状态下，胞外过量的ATP、酸性成纤维细胞生长因子 (acid fibroblast growth factor，FGF-1) 激活P2X7受体，P2X7受体C末端结构域内的Y 382-384通过蛋白酪氨酸激酶Src家族与PANX1形成复合物，P2X7R-PANX1复合物与IL-1β的成熟与释放密切相关，P2X7R-PANX1复合物通过激活caspase 1/3调控PRO-IL-1β转化为成熟的IL-1β。IL-1β激活谷氨酸受体1 (glutamate receptor-1，Glur1)参与一系列生理反应[22]，IL-1β还激活环氧化酶 (cyclooxygenase-2，COX-2) ，介导前列腺素2 (prostaglandin-2，PGE2) 的释放，揭示了P2X7受体可能通过COX/PGE途径参与疼痛等厌恶情绪中的调控。P2X7受体与P2X4受体显示出较高的同源性，有研究显示P2X4和P2X7亚基可以通过P2X7亚基的C-端相互作用，并且P2X4受体缺失影响P2X7诱导的细胞死亡和IL-1β从巨噬细胞的释放等作用。P2X7受体还激活P38 MAPK通路介导炎症反应以及参与疼痛调制过程[23]，P2X7受体通过介导K+和Ca2+的流动调控p38磷酸化[10]，进一步激活小胶质细胞中半胱氨酸组织蛋白酶S (Cathepsin S，CatS)的释放以及IL-18的释放，从而参与痛觉过敏。此外P2X7受体激活细胞外信号调节激酶 1/2 (extracellular signal-regulated kinase，Erk 1/2) 途径，调控肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)[24]，介导细胞增殖分化等生理活动。P2X7受体激活还导致多种炎症物质的释放，如激活转录因子3 (activating transcription factor 3，ATF3) ，趋化因子 2 (C-C motif chemokine ligand 2，CCL2) ，白介素-6 (Interleukin-6，IL-6) ，中性粒细胞趋化因子-1 (cytokine-induced neutrophil chemoattractant 1，CINC-1)。也有研究人员认为示P2X7受体在角叉菜胶诱导的机械性痛觉过敏的发展中的这种重要作用是通过依赖于先前释放的TNF-α，IL-6和CINC-1诱导初级传入伤害感受器的间接致敏来介导的，但不是通过IL-1β[25]。

3.3 P2X7受体介导的突触传递的变化Lecovei等[20]发现Src酪氨酸激酶参与P2X7受体介导的PANX1的激活，而Src激活NMDA受体是疼痛中枢敏化的关键步骤。初级传入神经的高频刺激，通过激活P2X7受体 ，释放细胞因子，触发了脊髓胶质细胞长时程增强(long-term potentiation，LTP)。有研究表明，神经损伤后, 小胶质细胞表面通过P2X7受体-p38途径释放微小囊泡即微泡 (microvesicles，MVs)。微泡一方面通过释放IL-1β参与炎症反应，另一方面释放神经递质影响突触后膜的兴奋性从而调控细胞的生命活动[15]。另外有研究发现，小胶质细胞中P2X7受体参与脊髓C-纤维诱发电位的长时程增强，而P2X7受体拮抗剂oxATP或BBG，可阻止脊髓LTP的诱导，并减轻机械性痛觉过敏。高频刺激C-纤维通过P2X7偶联的PANX1通道介导ATP，D-丝氨酸，谷氨酸等从胶质细胞中释放，继而诱导伤害性突触的LTP。

4 总结与展望

ATP是生命体重要的能量物质，同时也是痛觉传递中重要的信号分子，P2受体可能成为治疗疼痛的靶点。近年来大量的P2X7受体拮抗剂被合成，并且都表现出较好的药物特性，为P2X7受体在疼痛领域得以开展奠定基础。研究表明，P2X7受体介导炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6等的释放，拮抗P2X7受体能抑制炎症。然而，很少有报道称P2X7受体介导中枢神经系统炎症反应，P2X7受体在中枢炎症中到底发挥何种作用作用还不完全清楚。目前关于P2X7受体的研究集中在外周和脊髓水平，P2X7受体参与疼痛的研究还停留在疼痛信号传入的低位中枢阶段。以往研究表明，大脑中前扣带回，岛叶甚至海马参与疼痛情绪调控，这些过程是否有P2X7受体的参与还鲜有报道。总之，P2X7受体在炎症的产生和发展以及疼痛过程中起重要作用，阐明P2X7受体在疼痛信号调节过程中的作用，对于镇痛药物的发现以及镇痛手段的革新具有一定的指导意义。