石榴皮提取物对猪肉饼冷藏过程中脂肪氧化稳定性的影响

曹云刚，李 颖，李春强，赵倩倩，朱振宝,*，李保玲，秦雪翠

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；3.陕西嘉禾生物科技股份有限公司，陕西 西安 710077）

如今，肉干、肉饼等肉制品在世界范围内深受消费者欢迎[1]，肉制品加工和贮藏过程中的品质变化日益受到关注。已有许多研究表明，氧化会造成肉制品加工和贮藏过程中的品质变化[2-4]，其中脂肪氧化是导致肉制品品质下降的重要原因[5-7]。目前主要通过使用人工合成抗氧化剂来提高肉制品在加工和贮藏过程中的稳定性，但越来越多的研究表明，合成抗氧化剂的过度摄入对人体健康存在潜在危害。天然植物提取物富含酚类物质，具有抗氧化[8]、抗癌[9]和抗衰老等[8-11]多种生物活性。因此，天然植物源抗氧化剂在肉制品中的应用成为当前研究的热点[12-13]。

石榴皮中富含多酚类物质，其化学成分主要有生物碱类、黄酮类、有机酸和鞣质类等[14-15]，具有高效的抗氧化能力，是优良的天然抗氧化剂[16]。然而，目前石榴皮作为榨取石榴汁的副产物大都被丢弃，造成了优质资源的浪费。陕西省作为我国石榴生产大省，石榴皮资源丰富、开发利用率低，限制了相关产业的发展。并且目前关于石榴皮提取物在肉制品中的应用研究报道非常有限。

基于此，本研究选择陕西省优势天然资源产物石榴皮提取物，首先测定石榴皮提取物中的总酚和总黄酮含量，采用5 种方法对其抗氧化活性进行评价，进一步探究添加不同质量浓度石榴皮提取物对于猪肉饼冷藏过程中脂肪氧化的影响，旨在为天然抗氧化剂在肉制品中的科学合理应用提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪后腿肉 陕西省西安市未央区润家超市；石榴皮提取物（CSLP-A-708089） 陕西嘉禾生物科技有限公司；菲啰嗪 上海瑞永生物科技有限公司；正丁醇、2,2'-联氮双-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二胺盐（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ）、乙二胺四乙酸、抗坏血酸 天津市科密欧化学试剂有限公司；所用试剂均为分析纯或生物试剂。

1.2 仪器与设备

SE-A6全自动脂肪测定仪 济南市阿尔瓦仪器有限公司；HE 53水分测定仪 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；RADWAG WTC 2000电子天平 上海卡耐兹实验仪器设备有限公司；CP213电子天平 奥豪斯仪器（常州）有限公司；TP-350S智能数显磁力加热搅拌器 杭州米欧仪器有限公司；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；HR/T20MM立式高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；UV2900紫外-可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；GENIUS 4K台式低速离心机 长沙市鑫奥仪器仪表有限公司；RS-JR80A绞肉机 合肥荣事达三洋电器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总酚和总黄酮含量测定

参照高玉萍等[17]的方法，采用福林酚标准曲线法测定石榴皮提取物中的总酚含量。将石榴皮提取物稀释为一系列不同质量浓度（0、50、100、200、300、400、500、1 000 µg/mL）的样品溶液，准确移取1 mL稀释样品，置于50 mL容量瓶中，加入10 mL蒸馏水，再先后加入5 mL福林酚试剂、4 mL 7.5% Na2CO3溶液，定容；避光反应1 h后于765 nm波长处测定吸光度。以没食子酸为标准品绘制标准曲线，样品的总酚含量以没食子酸当量（mg/g）表示。

参照柴建新等[18]的方法，并稍作修改，测定石榴皮提取物中的总黄酮含量。准确移取1 mL稀释样品，置于50 mL容量瓶中，加入14 mL无水乙醇，再加入硝酸铝溶液、醋酸钾溶液各1 mL，定容；静置1 h后于420 nm波长处测定吸光度。以芦丁为标准品绘制标准曲线，样品中的总黄酮含量以芦丁当量（mg/g）表示。

1.3.2 总抗氧化能力测定

参照刘芸等[19]的方法，采用亚铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）法进行总抗氧化能力测定。取1 mL样品溶液置于10 mL玻璃试管中，加入0.3 mL去离子水和3.0 mL FRAP工作液混匀，37 ℃条件下水浴4 min后于593 nm波长处测定吸光度。相同实验条件下，以不同浓度FeSO4标准溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）替代样品溶液，以FeSO4浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。样品的FeSO4还原能力用对应的Fe2+浓度表示。

1.3.3 自由基清除能力测定

参照Jiang等[20]的方法，并稍作修改，测定ABTS+·清除能力。准确移取30 µL样品溶液置于10 mL玻璃试管中，加入2.97 mL ABTS+·工作液，混匀后室温下反应10 min，于734 nm波长处测定吸光度。

参照刘翠[21]的方法，测定石榴皮提取物的·OH和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力。

1.3.4 Fe2+螯合能力测定

参照曹云刚[22]的方法，测定石榴皮提取物的Fe2+螯合能力。

1.3.5 猪肉预处理及基本指标测定

猪肉基本指标测定：将新鲜猪后腿肉用装配有不同直径孔板的绞肉机绞碎，将绞碎的肉糜充分混匀，称取3 g左右肉糜，使用HE 53水分测定仪测得其水分含量为（75.22±0.03）%，使用SE-A6全自动脂肪测定仪测得其脂肪含量为（6.37±0.26）%。

猪肉饼的制作：按照表1配方，以小培养皿为模具制作成质量约40 g的肉饼，用电饼铛进行煎烤（每面煎烤1 次，每次2 min），放置于塑料托盘中用保鲜膜密封，置于4 ℃冷藏。于冷藏第1、3、5、7天测定猪肉饼的过氧化值（peroxide value，POV）及硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值，评价其脂肪氧化程度。

表 1 猪肉饼配方Table 1 Formulation of pork patties

1.3.6 猪肉饼脂肪氧化情况测定

POV的测定：称取2～3 g肉糜样品（记录准确质量），加入30 mL氯仿-冰乙酸混合液和1 mL饱和碘化钾溶液，混匀后置于暗处反应5 min；加入50 mL去离子水和1 mL淀粉指示剂，用0.01 mol/L Na2S2O3标准滴定溶液滴定至浅黄色。

TBARs值的测定：称取1.0～1.5 g肉糜样品（记录准确质量），依次加入1.5 mL硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）溶液及8.5 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，100 ℃条件下水浴30 min；冰水浴冷却至室温后，取5 mL上清液，加入5 mL氯仿离心（3 000 r/min、5 min）后，取3 mL上清液加入1.5 mL石油醚再次离心（3 000 r/min、5 min），吸取下层液体于532 nm波长处测定吸光度。结果以丙二醛（malondialdehyde，MDA）当量（mg/kg）表示。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel软件进行数据分析，测定结果以平均值±标准差的形式表示；采用Statistix 9.0软件进行差异显著性分析（P＜0.05）；采用Sigmaplot 12.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 石榴皮提取物的总酚和总黄酮含量

实验结果表明，石榴皮提取物中的总酚含量为（8 9.4 8±6.5 9） m g/g，总黄酮含量为（57.60±4.91） mg/g。夏米斯巴奴·艾则孜等[23]研究发现，石榴皮中总多酚含量为67.50 mg/g；杨肖等[24]研究发现，石榴皮粉末中总黄酮含量为112.13 mg/g。不同研究报道中石榴皮及其提取物的总酚和总黄酮含量相差较大，这与实验所用石榴皮的种类等不同有关。

2.2 石榴皮提取物的总抗氧化能力

图1 不同质量浓度石榴皮提取物的总抗氧化能力Fig. 1 Total antioxidant capacity of pomegranate peel extract at various concentrations

由图1可知，随着石榴皮提取物质量浓度的升高，其总抗氧化能力呈现不断上升的趋势。当石榴皮提取物质量浓度在50～400 µg/mL范围内时，其总抗氧化能力增幅相对较缓，石榴皮提取物的质量浓度为50 µg/mL时，其总抗氧化能力约为0.01 mmol/L，石榴皮提取物质量浓度增大至400 µg/mL时，其总抗氧化能力增强至0.11 mmol/L，约为起始质量浓度（50 µg/mL）的10 倍。而当石榴皮提取物质量浓度在400～1 000 µg/mL范围内时，其抗氧化能力迅速增强，石榴皮提取物质量浓度为1 000 µg/mL时，其总抗氧化能力约为0.52 mmol/L，约为质量浓度为400 µg/mL时的5 倍。许海燕[25]研究发现，石榴皮粗提物质量浓度越高，其抗氧化能力越强，当石榴皮粗提物质量浓度为0.1 mg/mL时，其抗氧化能力约为VC的1/2，而石榴皮粗提物质量浓度达0.3 mg/mL时，其总抗氧化能力达到VC的1.25 倍左右，与本研究结果类似。

2.3 石榴皮提取物的自由基清除能力

图2 不同质量浓度石榴皮提取物的自由基清除能力Fig. 2 Radical scavenging activity of pomegranate peel extract at various concentrations

由图2可知，当石榴皮提取物质量浓度为50 µg/mL时，其·OH清除率达77.23%，此后，随着石榴皮提取物质量浓度的增加，其·OH清除率缓慢增强，当石榴皮提取物质量浓度为200 µg/mL时，其·OH清除率几乎接近峰值，约为92.22%。整体来看，石榴皮提取物的ABTS+·和DPPH自由基清除能力随其质量浓度增加的变化趋势基本一致：随质量浓度增加而迅速增强，当石榴皮提取物质量浓度为50 µg/mL时，其ABTS+·和DPPH自由基清除率分别约为10.84%和4.69%；当石榴皮提取物质量浓度达1 000 µg/mL时，其ABTS+·和DPPH自由基清除率分别达99.61%和87.37%，约为初始质量浓度（50 µg/mL）的10 倍和20 倍。

初始质量浓度（50 µg/mL）时，石榴皮提取物的自由基清除能力为：·OH（77.23%）＞ABTS+·（10.84%）＞DPPH自由基（4.69%）；当质量浓度为1 000 µg/mL时，其3 种自由基清除率均达到最大值：ABTS+·（99.61%）＞·OH（94.97%）＞DPPH自由基（87.37%）。唐丽丽[26]的研究表明，石榴皮提取物质量浓度在0～500 µg/mL范围内时，其ABTS+·和DPPH自由基清除能力与质量浓度呈正相关，当质量浓度分别达到500、800 µg/mL时，其ABTS+·和DPPH自由基清除能力均达到峰值（90%以上）。不同研究中石榴皮提取物对ABTS+·、·OH和DPPH自由基的清除能力有一定差异，这可能与石榴种类和石榴皮提取物的提取方法不同有关。

2.4 石榴皮提取物的Fe2+螯合能力

图3 不同质量浓度石榴皮提取物的Fe2＋螯合能力Fig. 3 Fe2+ chelating activity of pomegranate peel extract at various concentrations

由图3可知，石榴皮提取物对Fe2+的螯合能力具有明显的质量浓度依赖性，其Fe2+螯合能力随质量浓度增大而显著增强。当石榴皮提取物质量浓度为50 µg/mL时，其Fe2+螯合能力约为9.77%；当石榴皮提取物质量浓度达到1 000 µg/mL时，其Fe2+螯合能力达到34.75%，约为初始质量浓度（50 µg/mL）时的3.6 倍。陈龙[27]研究发现，当石榴皮提取物质量浓度为0.02～1.25 mg/mL时，其Fe2+螯合能力与质量浓度呈正相关，质量浓度为1.25 mg/mL时，其Fe2+螯合能力约为35.65%，与本研究结果类似。

2.5 石榴皮提取物的添加对猪肉饼冷藏过程中脂肪氧化稳定性的影响

脂肪氧化是导致肉制品品质劣变的重要原因。脂肪氧化的初级产物是过氧化物，过氧化物本身不稳定，容易进一步分解生成小分子的醛、酮、酸等次级氧化产物[28-29]。本研究通过测定POV和TBARs值分析猪肉饼贮藏过程中的脂肪初级和次级氧化程度[30]。

图4 猪肉饼冷藏过程中的POV变化Fig. 4 Changes in POV of cooked pork patties during cold storage

由图4可知，空白对照组猪肉饼的POV在冷藏过程中随着时间延长而增大，表明在整个贮藏期内猪肉饼中的脂肪氧化持续进行。贮藏第1天时，空白对照组猪肉饼的POV约为4.39 meq/kg，BHA组和A1组的POV约为2.53、2.36 meq/kg，A2组和A3组约为1.59、1.50 meq/kg，可见，抗氧化剂的添加明显降低了猪肉饼的POV，说明抗氧化剂添加明显抑制了脂肪氧化。整体来看，BHA组和A1组猪肉饼的POV在整个贮藏期内数值接近且变化趋势一致，说明添加较低含量的石榴皮提取物（0.01%）与添加0.01%的BHA对猪肉饼中脂肪初级氧化的抑制效果相当。随着石榴皮提取物添加量的增大，其抑制效果显著增强（P＜0.05），但A2和A3组之间并未表现出显著性差异，说明当石榴皮提取物的添加量为0.05%时，其对脂肪初级氧化的抑制效果已达到最佳。Turgut等[31]研究发现，石榴皮提取物能显著抑制牛肉丸冷冻贮藏过程中的脂肪氧化（POV和TBARs值），且达到一定质量浓度（500 µg/mL）时其抑制效果最强，与本研究结果类似。

图5 猪肉饼冷藏过程中的TBARs值变化Fig. 5 Changes in TBARs value of cooked pork patties during cold storage

由图5可知，空白对照组猪肉饼的TBARs值在冷藏过程中随着时间的延长一直增大，且贮藏1～5 d时增长较快，此后增长速率放缓。贮藏第1天时，空白对照组猪肉饼的TBARs值约为2.57 mg/kg，BHA组和A1组均小于1.50 mg/kg，A2组和A3组均小于0.50 mg/kg，说明抗氧化剂的添加明显抑制了猪肉饼的脂肪氧化。对于BHA组和A1组来说，贮藏1～5 d时，其TBARs值随贮藏时间的延长而缓慢上升，第5天时TBARs值达到峰值（分别约为3.18、2.66 mg/kg），此后TBARs值随贮藏时间的延长略有下降。这可能是由于MDA与肉饼中的蛋白质发生共价结合，导致其含量降低。高含量石榴皮提取物（0.05%和0.10%）的添加几乎完全抑制了猪肉饼TBARs值的增长，在整个贮藏期内，2 组猪肉饼的TBARs值均低于0.55 mg/kg。与POV实验结果类似，A2和A3组之间的TBARs值无显著性差异，再次说明当石榴皮提取物的添加量为0.05%时，已足以抑制猪肉饼中的脂肪氧化。Turgut[31]、Cao[32]等在其他体系中也得到了类似的研究结果，植物多酚优良的脂肪氧化抑制能力主要归因于其高效的自由基清除能力及一定的金属离子螯合能力。

3 结 论

本研究所用石榴皮提取物中的总酚和总黄酮含量分别为（89.48±6.59） mg/g和（57.60±4.91） mg/g。总体来讲，石榴皮提取物的总抗氧化能力表现出明显的质量浓度依赖性，在50～1 000 µg/mL范围内增速迅猛，总抗氧化能力由0.01 mmol/L增强至0.52 mmol/L，增强50多倍。石榴皮提取物为初始质量浓度（50 µg/mL）时，其对3 种自由基的清除率为·OH（77.23%）＞ABTS+·（10.84%）＞DPPH自由基（4.69%）；质量浓度增大至200 µg/mL时，其对·OH的清除率几乎接近峰值，约为92.22%；质量浓度增大至1 000 µg/mL时，其对ABTS+·和DPPH自由基的清除率分别增大至99.61%和87.37%。石榴皮提取物的Fe2+螯合能力随质量浓度增大而增强：质量浓度为50 µg/mL时，其Fe2+螯合能力约为9.77%；当质量浓度达到1 000 µg/mL时，其Fe2+螯合能力达到初始质量浓度（50 µg/mL）时的3.6 倍。

石榴皮提取物可以有效抑制猪肉饼冷藏过程中的脂肪氧化（POV和TBARs值）：石榴皮提取物添加量为0.01%时，其脂肪氧化抑制效果与0.01%（以脂肪含量为基准）BHA相近；随着石榴皮提取物添加量的增加，其脂肪氧化抑制效果显著增强，但添加量为0.05%和0.10%时的抑制效果无显著性差异。