脑缺血后周细胞及相关血管生成信号通路的研究进展

张荻，徐鸣曙，张英杰，程爱芳，管华宗

1.上海中医药大学，上海市200120；2.上海市针灸经络研究所，上海市200030

以往针对脑缺血研究大多以神经元本身为重点，并形成神经元保护策略。最近几年逐渐转变为对神经和血管整体保护的神经血管单元(neurovascular unit,NVU)保护策略，兼顾大脑各结构的整体性和联系性。目前脑缺血的治疗方法仍以溶栓为主，而溶栓疗法侧重溶解血栓，使动脉再通，恢复血流灌注，并未考虑对神经的保护作用，且有严格时间窗限制及诸多不良反应，故寻求新法十分必要。

脑缺血后，特别是缺血梗死灶周边区域的血管生成一定程度上改善了缺血半暗带血流，为神经再生和突触发生创造条件；血管生成、神经功能恢复，也决定着脑梗死患者的预后[1-2]。新生血管形成并不是仅以血管内皮细胞为主导的独立修复机制，而是以NVU为整体的多种组分间相互作用，包括神经再生、突触重塑等多种修复机制。本文旨在明确周细胞相关的血管形成机制，能更好利用新生血管形成调控NVU稳态，为临床治疗缺血性脑卒中提供新方向。

新生血管主要由内皮细胞、周细胞和基底膜构成，其形成实质是内皮细胞增殖、迁移和重组。机体新生血管形成包括两种形式，即血管发生和血管生成(又称血管新生)。血管发生指未分化的前体细胞在原位分化为内皮细胞，再组装成血管迷路的过程；血管生成指从原始血管网络生长和重塑形成有成熟结构功能的血管网络过程，包括内皮细胞活化、迁移和增生。血管发生不同于血管生成，是血管生成的前提和基础。血管生成主要包括内皮细胞激活、出芽与迁移以及血管成熟，内皮细胞对周细胞的募集作用在适时终止血管形成过程并使其形成有正常功能的成熟血管过程中发挥重要作用[3]。

周细胞是一类广泛分布于全身微血管系统，存在于内皮细胞与基底膜之间的结构细胞。大脑中周细胞与内皮细胞数量比例为1∶3～1∶1[4]，其与内皮细胞构成微血管和组织间隙屏障。周细胞与内皮细胞不仅在结构上密切相关，且通过近分泌(或称细胞连接)或旁分泌的方式调节新生血管形成。周细胞的募集对血管生成必不可少，其通过给予新生内皮细胞物理和化学性的支持来维持血管稳态。受缺血缺氧等因素的影响，内皮细胞激活启动血管生成，在一些细胞因子的作用下，内皮细胞继而发生增殖、迁移，萌生新生血管芽，血管芽在血流冲击下形成管腔，同时招募间质中周细胞黏附于新生血管，共同参与血管生成[5]。

1 近分泌

近分泌为周细胞与内皮细胞直接接触，发挥细胞协同作用。

1.1 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信号通路

VEGF是一种特异的血管内皮细胞有丝分裂原，它通过与内皮细胞表面相应受体结合，激活相关转导通路，调控血管生成过程。VEGF介导的各信号级联分别参与血管生成各个过程，直接调控血管生成的发生发展，对血管生成发挥举足轻重的作用。

生理条件下，VEGF在成熟器官中表达较低，而在一些代谢旺盛、血供丰富的组织细胞中表达较高，表明VEGF与组织器官的发育密切相关，且有研究证明其对各组织器官血管内皮细胞起增殖、迁移和趋化的作用[6]。病理或缺血缺氧状态下[7]，周细胞大量产生VEGF等促血管生成因子，VEGF与内皮细胞上的VEGF受体结合发挥作用[8]；同时在胞外基质蛋白酶的作用下，血管基底膜溶解，血管内皮细胞向血管外游离，而逐渐形成新生血管，新生血管经过重塑逐步形成稳定成熟的血管网络[9]。

周细胞和内皮细胞间的相互作用在血管生成中具有极为重要的作用，VEGF在这一过程中扮演重要角色。新生血管形成初期，周细胞通过分泌VEGF和白细胞介素(interleukin,IL)-6，促进血管内皮细胞增殖，促进新生血管出芽[10]。VEGF大量分泌，可介导血管内皮细胞快速分泌血管生成素-2(angiopoietins-2,Ang-2)，加速基底膜和壁细胞(或周细胞)分解[11]，而血管内皮细胞从基底膜分解处开始形成新生血管芽前体——足体环，该结构由大量内皮细胞聚集而成。同时VEGF介导胞内Notch-Dll4等信号通路促内皮细胞分化为顶端细胞(或尖端细胞)和柄细胞。顶端细胞具有较强的迁移能力，其向前伸出丝状伪足，决定新生血管芽生长的方向和路径[12]，同时还负责建立错综复杂的新生血管网络[13]；顶端细胞附近的周细胞可分泌内源性VEGF，保护内皮细胞免于凋亡；柄细胞有强大的增殖能力，负责形成管腔，维持新生血管芽的稳定与成熟[12]，随后由周细胞/平滑肌细胞覆盖，形成有功能的成熟新生血管。缺血性脑卒中发生后，梗死区的不同细胞中均能表达VEGF，但程度各异[14]，血清VEGF浓度与脑梗死面积、长期预后存在一定相关性[15]。脑缺血发生后，缺血脑组织中VEGF的表达在缺血后4 d内达到高峰，7～10 d后下降至正常水平；脑内注射外源性VEGF能促进缺血半暗带区残存毛细血管内皮细胞增殖、迁移和成熟，从而起促进血管生成、恢复灌注、降低血管通透性的积极作用[16-19]。

VEGF是目前研究最全面的促血管生成因子，其介导各信号通路广泛参与血管生成整个过程，控制血管网络的发生发展，在血管生成过程中扮演重要角色。周细胞与内皮细胞共生共存关系提示两者联合治疗或对缺血性脑卒中后预后发挥积极效应。

1.2 Notch信号通路

Notch信号通路是血管腔隙中高度保守的信号通路，参与调控正常成人血管生成，对原始血管丛重塑、成熟起重要作用[19]；抑制Notch信号通路将损害缺血后的修复性血管生成[20]，可导致新生血管发育和/或稳态异常[15]。Notch信号途径不仅调控内皮细胞和平滑肌细胞(或周细胞)的命运与功能，且对血管以及周细胞的发育和稳态的维持起重要作用。

哺乳动物的Notch基因可以编码4种Notch受体(Notch 1～4)，5种Notch配体分别为Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1和Jagged2。通常情况下，Notch信号的活化需要细胞间的直接接触，即配受体结合以启动Notch信号通路。血管平滑肌细胞和周细胞表达Notch3受体，与配体Jagged1结合后可以促进周细胞增殖、分化或存活；血管内皮细胞表达Notch1、Notch4以及Dll1、Dll4和Jagged1。Dll4和Jagged1在血管生成过程中起重要作用，其中Dll4从根本上参与调控VEGF启动的血管萌出。Dll4主要集中于新生血管末端顶端细胞中[21]，VEGF是Dll4的正向调节因子，可诱导内皮细胞中Dll4和Notch1表达；而Dll4为VEGF的负反馈调节因子[22]，Dll4的表达对VEGF反应起限制顶端细胞形成作用。

Notch信号通路与VEGF共同参与调控血管生成的过程，调节Notch信号通路可以促进血管生成[23]。血管生成过程中，VEGF促进血管内皮细胞增殖和迁移，形成新血管芽的同时，也促进顶端细胞Dll4表达。Notch信号通路配受体结合启动一系列胞内活动，下调VEGF受体，抑制VEGF反应，在VEGF的负反馈机制作用下，血管得以在合适的生长密度下形成有功能的成熟血管。此外，Notch信号通路也与周细胞增殖、募集密切相关[24]，Dll-Notch信号通路在胚胎发育过程中作用于血管分支形成及形态。Dll4通过作用于动脉结构和功能，负向调节血管萌生，进而影响组织灌注；而Jagged1则为Dll4的竞争性抑制配体，其作用主要为促进周细胞募集、增殖、分化和存活，敲除Jagged1基因会导致小鼠血管缺陷，但特异性地敲除血管内皮的Jagged1基因并不妨碍动脉分化[25]。敲除血管平滑肌细胞中Notch信号关键转录因子阻断Notch信号传导，可导致血管发育和/或稳态的异常。

Notch信号通路在缺血性脑卒中动脉侧支网络的形成过程中起决定作用，上调Notch信号通路有利于缺血脑组织的血管生成，抑制Notch信号通路则不利于缺血后修复性血管生成[20]。Notch1是Notch信号通路的主要受体，参与多脏器缺氧或缺血/再灌注的损伤过程[26]。脑缺血后VEGF表达与Notch1呈正相关，调控VEGF/Notch1信号通路可改善大鼠脑缺血性脑损伤[27]；可能因为缺血缺氧环境诱导VEGF等生长因子表达上调，从而诱导Notch1表达，调控局部血管生成[28]。Notch信号通路在脑缺血疾病中的作用机制十分复杂，其在血管生成中的作用仍需进一步探索。

2 旁分泌

旁分泌通过弥散作用，调协细胞活动。

2.1 Ang/Tie信号通路

Ang/Tie信号通路在血管形成后期，对血管重塑、成熟以及维持稳定空间结构中发挥关键作用。Ang与VEGF功能类似，在胚胎发育、多种病理过程中协同作用，共同调节血管生成过程。

Ang与Tie以配受体形式结合后调控内皮细胞与周细胞存活和血管成熟稳定。Ang是血管生长必需的因子，也作为一种强效血管保护剂，由血管周围细胞表达。Ang家族由Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4四种分型组成，均为Tie2受体的配体。在4种分型中，Ang-1和Ang-2最为重要。Ang-1由平滑肌细胞、周细胞和其他血管周围细胞表达，不仅促进新生血管的正确装配、成熟和重塑，还能对抗由VEGF引发的血管通透性升高[29]，维持成熟血管系统的稳定和结构完整。Ang-2由内皮细胞和平滑肌细胞表达，可以拮抗Ang-1的作用。Tie受体是酪氨酸蛋白激酶受体家族，主要包括Tie1和Tie2。Tie1由血管内皮细胞表达，其细胞外结构域在VEGF刺激下可参与Tie2信号传递[30]；Tie2主要由血管周围细胞表达。Ang-1、Ang-2与Tie2受体有相同的亲和力。

Ang/Tie2信号通路可维持新生血管稳定。Ang-1结合Tie2，使其磷酸化，可增加血管周围细胞向内皮细胞迁移，减少血管渗漏[31]，同时可上调内皮细胞的肝素结合表皮生长因子(heparin binding epidermal growth factor,HB-EGF)表达，增加其与周细胞膜表面EGF受体结合力，从而调节周细胞的运动，增加血管稳定性[32]。Ang-2通过竞争性结合Tie2受体，减少内皮细胞与周细胞间的接连，影响周细胞对血管的覆盖[33]。如上所述，Ang-1和Ang-2虽起着相反的作用，但共同维持着血管稳定。

Ang-1/Tie2信号对内皮细胞的调节作用是通过调节VEGF信号，影响基底膜和壁细胞(周细胞)降解实现的。在血管生成后期，Ang-1高表达促进壁细胞(周细胞)募集与稳定，周细胞产生大量VEGF，介导内皮细胞分泌大量Ang-2，从而降解周细胞，导致VEGF信号逐渐减弱，血管壁通透性增加，从而促进血管网络的稳定与成熟[34]。脑缺血恢复期，血管生成素Ang/Tie信号通路激活，促进内皮细胞增殖与血管生成[35]，其介导下缺血半暗带的血管生成在一定程度上有利于卒中后NVU的自我修复。

2.2 血小板衍生生长因子-B(platelet-derived growth factor subunit B,PDGF-B)及其受体通路和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路

PDGF-B通路和TGF-β信号通路均为周细胞发育和功能调节的关键信号通路。

PDGF受体信号通路在血管生成过程中对周细胞募集起关键作用。在血管发育生成中，血管内皮细胞合成并分泌PDGFB，特别是在新生血管芽顶端，PDGF-B的浓度较高，其与表达在周细胞表面的PDGF受体-B相结合，促进周细胞增殖与迁移，周细胞被募集在内皮细胞周围；与此同时周细胞可分泌VEGF，通过旁分泌的方式作用于内皮细胞，以维持血管内皮细胞的稳定，促进血管重建与成熟[36]。阻断PDGF-B信号转导，抑制内皮细胞外周细胞集聚，失去周细胞包裹的内皮细胞将发生细胞凋亡。

TGF-β信号通路可诱导血管平滑肌细胞和周细胞生成。周细胞和内皮细胞均以前体形式分泌TGF-β，其受体类型分三种[37]：TGF-βⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型。TGF-βⅠ和Ⅱ型受体主要存在于缺血梗死灶周围神经元、活化星形胶质细胞、内皮细胞以及巨噬细胞表面[38]，Ⅰ型和Ⅱ型受体对TGF发挥作用缺一不可。Ⅲ型在中枢系统的研究不多见。TGF-βⅠ型可分为ALK1和ALK5两型，生理状态下，内皮细胞表达ALK1和ALK5，周细胞仅表达ALK5。ALK1促进细胞募集，ALK5则诱导细胞静止[39]，下调ALK1信号和上调ALK5活性可干扰内皮细胞的增殖、迁移和分化，扰乱血管平滑肌细胞的募集和分化，从而导致血管完整性损伤和周细胞覆盖率降低。另外，TGF-β信号通路还对周细胞分化起重要作用，当其受抑制时，血管周围细胞的前体分化为周细胞系的比例明显降低，间接破坏血管壁的完整性[39]。

TGF-β与PDGF-B共同参与诱导血管周围的间质细胞分化为周细胞和平滑肌细胞，并对周细胞起增殖、募集、趋化和迁移作用[40-42]，周细胞募集至内皮细胞并与其形成适当的接触后，TGF-β通过自分泌或旁分泌的方式调节相应的黏附蛋白和神经钙黏素(N-Cadherin)等黏附分子以实现脑内周细胞与内皮细胞之间的黏附[43]，并自我反馈调节其合成及分泌量。

2.3 鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SPK)/鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)信号通路

SPK/S1P信号通路激活引起细胞骨架、细胞黏附及胞间连接的变化，从而影响细胞的增殖、移行和存活。

哺乳动物的SPK主要有两种亚型：SPK1和SPK2。SPK1主要表达于内皮细胞、肾脏及心血管系统，主要表达于细胞胞质，参与细胞的存活及增殖[44]；而SPK2主要表达于脑组织细胞中的内质网、胞核和线粒体中，与细胞凋亡等密切相关[45]，对大脑缺血缺氧等应激损伤具有重要的保护作用。SPK主要通过其催化产物S1P实现多种生物学作用。S1P主要由内皮细胞表达，通过广泛结合表达于内皮细胞的S1P受体1、S1P受体2、S1P受体3，在周细胞到达指定位置之前对血管生成起双向调控作用[46]。S1P受体1与S1P受体3均大量表达于血管内皮细胞中，而S1P受体2仅在内皮细胞的某些特定部位表达[47]。目前对S1P受体1的研究较多，在生理条件下，脑组织中S1P受体1表达较少，S1P通路活性较低；在应激条件下，脑组织中S1P受体1表达显著上调，S1P通路被激活[48]。

S1P与VEGF具有相似的生理功能[49]，S1P通过自分泌和/或旁分泌的形式，调节血管发生和发展，并维持新生血管的成熟和稳定[50]。S1P可以激活VEGF受体，介导细胞迁移，而VEGF受体抑制剂则能阻断S1P介导的细胞迁移[51]。VEGF在蛋白激酶C介导下，可激活SPK通路，诱导S1P合成增强，通过S1P受体1和S1P受体3促进血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成等[51]，通过S1P受体2则抑制内皮细胞迁移。同时，SPK/S1P通路可调控血管平滑肌和周细胞向新生血管周围迁移和聚集。此外，S1P可通过调控Ca2+水平参与细胞生长，也可通过自分泌或旁分泌途径，参与血管增殖、成熟，调控细胞骨架重排及细胞连接中以N-Cadherin、血管内皮细胞钙黏素(VECadherin)为基础的连接，而N-Cadherin作为VE-Cadherin的上游调节因子，不仅自身发挥功能，还激动VE-Cadherin发挥功能，调节脑内周细胞与内皮细胞之间的黏附[38]。

3 其他信号通路

VEGF信号通路、Notch信号通路、Ang/Tie信号通路、TGF-β信号通路和SPK/S1P信号通路在内皮细胞-周细胞介导的内源性损伤修复机制中发挥着主要作用。此外，Shh/Ptc信号通路对Ang信号有调节作用[52]，会引起血管生成，能够促进血管平滑肌细胞生长和存活，同时可参与周细胞募集[53]；基质细胞衍生因子1α/CXCR4通路参与周细胞募集、迁移，还可与造血细胞因子、干细胞因子和IL-3产生协同作用，调节内皮细胞形成和成熟及周细胞的募集[54]；人HB-EGF/ErbBs通路参与周细胞的募集[55]；Eph/ephrin信号通路不仅调节血管生长，还调控血管壁上内皮细胞和周细胞行为[56]。

以上通路在周细胞、内皮细胞参与的脑微血管发生、募集和分化等进程中发挥协同作用，共同维持NVU结构和功能的完整性及协调性。

4 小结与展望

总体来说，NVU作为一个功能单元，在脑缺血发生时，缺血缺氧导致该功能单元的稳定与平衡被破坏，周细胞在血管生成和成熟过程中必不可少，其参与内皮细胞的激活、出芽和迁移，同时也在内皮细胞稳定和成熟上发挥巨大作用[19]，从而改善NVU失衡状态。

周细胞与内皮细胞作为NVU中重要组成部分，其通过多种信号通路及细胞分子之间的相互作用，形成复杂的分子信号网络，参与脑缺血不同时期NVU内源性损伤与修复过程，共同调节生理和病理条件下的NVU，包括微血管生成、微循环调节和内环境稳定等。

周细胞与内皮细胞参与NVU内源性机制十分复杂，目前尚未完全阐释清楚。在脑缺血等疾病的发生发展过程中，往往伴随周细胞、内皮细胞形态和/或功能的变化。以往认为内皮细胞为新生血管形成的主导者，周细胞在血管形成后期共同参与完成血管重塑及稳定。最近的研究显示，在血管形成早期，周细胞或早于内皮细胞起主导作用，构成血管芽，引导新生血管形成[19]。

总之，周细胞与内皮细胞相互作用，引导血管芽生，促进血管生成，对治疗脑缺血等疾病具有重要指导意义。