啮齿动物痉挛模型常用的评定方法

吴晓燕，金荣疆

成都中医药大学，四川成都市610075

痉挛常见于脑卒中、脊髓损伤、脑瘫、多发性硬化等多种中枢神经系统疾病，属于上运动神经元综合征的组成部分之一[1]。脊髓损伤引起的痉挛通常表现为屈肌和伸肌缓慢增加兴奋性和过度活动；脑部病变通常会导致兴奋的快速积聚，并且偏向于反重力肌肉的参与；慢性痉挛可导致相关和邻近肌肉的流变性质的变化[2]。临床上最初将痉挛定义为由于牵张反射的过度兴奋性引起的强直性肌腱反射的速度依赖性增加[3]。伴随着研究的深入，研究者们逐渐认识到肌肉张力增加，不仅是因为反射活动增加，而且还可能更多地是由于肌肉的内在特性发生变化引起的[4]。

痉挛研究依赖于优质动物模型，而优质的动物模型又依赖于能够敏锐地检测出模型动物痉挛差异的测量方法。啮齿动物常常被用来制作痉挛动物模型，定性和定量的痉挛评定方法经常用于判断痉挛的程度，还可以对痉挛治疗的效果进行比较。

1 行为学观察

观察大鼠行为学的改变便于对模型进行初步的判断，识别受痉挛影响的大鼠模型。不同类型的痉挛模型大鼠可能会有不同的行为学改变。如选择性将5-羟色胺再摄取抑制剂直接微量注射到大鼠红核后，产生斜颈肌痉挛，并且肌张力障碍的发作伴随着面部肌痉挛，空虚咀嚼动作和梳理动作增多[5]。

遗传性痉挛性截瘫(hereditary spastic paraplegias,HSPs)大鼠表现出年龄依赖性的进行性步态缺陷，其特征在于后肢运动协调性差，躯干不稳定以及开始运动困难。最早的异常是通过后肢异常姿势表现的，其特征是明显的内收，通常导致后肢交叉爪子在内部旋转，倒置并相互扣合，而正常野生型大鼠用爪外旋保持其后肢[6]。

脊柱S2水平横断仅影响尾部肌肉组织，并在2周后开始导致慢性尾部痉挛，且持续无限期[7]。当尾巴无约束时，尾巴自发或反射性屈肌和伸肌痉挛盘绕，移动期间经常在尾巴末端引发阵挛。轻微接触尾毛和皮肤时，尾巴迅速撤回。Bennett等[8]描述了S2横断后大鼠尾部肌肉组织痉挛的4个阶段。脊髓撞击损伤痉挛模型经常表现出后肢伸肌痉挛并且容易诱发阵挛[9]。

大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠痉挛模型因其张力变化微弱不易被感知，常观察到痉挛明显大鼠出现运动启动困难，腕掌关节屈曲握拳状，后肢伸展过度等行为改变。

2 定量评价

通常大尺寸的装置难以应用于啮齿动物模型。因此，需要开发各种微型评估装置用于量化大鼠的肌张力。

2.1 H反射

上运动神经元损伤后，脊髓中枢失去上位中枢的控制，导致节段内中间神经元和运动神经元活性的改变，以致相应电生理活性改变。

H反射是常用的电生理检查方法，用于了解脊髓节段内α运动神经元、γ运动神经元、闰绍细胞及其他中间神经元的活性[10]。

H/M比：在痉挛大鼠中，随着中枢神经的丧失和脊髓运动神经元的活动增加，H反射的振幅将增加；M波的振幅不会改变；结果Hmax∶Mmax比增加[11]。

另外常用指标为H反射的频率依赖性抑制(rate-dependent depression,RDD)：通过逐渐增加刺激频率，正常大鼠肌肉H反射振幅被抑制，痉挛时，H反射在高频率的刺激下，振幅下降不明显，RDD减弱，表明脊髓反射兴奋性增高[12]。

Escobar-Corona等[13]的研究表明，脊髓损伤大鼠的H反射振幅和H/M比与正常大鼠相比显著增强，电针治疗的脊髓损伤大鼠表现出H反射振幅和H/M比的减少，并且促进H反射的频率依赖性振幅抑制。

Cordero等[14]通过在大鼠中诱发H反射，研究饮食干预降低痉挛的功效，发现随着刺激频率的增加，脊髓损伤大鼠H反射抑制减少，服用维生素E补充饮食的大鼠H反射抑制改善。Lee等[12]在小鼠的嘴侧和尾侧前肢运动区诱导光致血栓形成来建立脑卒中痉挛性小鼠模型，与假手术小鼠相比，脑卒中小鼠受累肌肉中的RDD显著减弱，并且持续8周。同样，宗海洋等[15]也在光化学损伤单侧运动皮质致大鼠后肢痉挛性偏瘫模型中验证了H反射RDD在痉挛侧肢体中明显降低。

2.2 超声弹性成像(ultrasound elastography,UE)

UE是一种新兴的技术，用于实时无创监测弹性组织特性。在肌肉骨骼领域，超声应变弹性成像可以成功地检测到肌肉硬度的变化。对于一些肌肉结构已发生微小变化，但尚未引起显著力学改变等情况，其阻抗改变不易被测试者感知，用分级量表区分肌张力变化十分困难[16]。UE是通过检测外力或超声波作用下组织应变、应变率或剪切波速度等参数来判断组织硬度，对目标进行组织机械特性定量及可视化定性研究[17]。

UE在临床中可应用于脑卒中、脊髓损伤和脑瘫所致的肌痉挛评定[18]。在啮齿动物模型中，Johannsen等[19]利用UE检测大鼠药理学刺激后局部骨骼肌的弹性反应。Wijesinghe等[20]报道新鲜的离体大鼠腓肠肌和小鼠腹部横断肌肉和结缔组织之间的黏弹性对比，这说明UE检测大鼠骨骼肌弹性的可行性。Jiang[21]等应用UE评估脊髓损伤痉挛大鼠腓肠肌的硬度，结果显示随脊髓损伤大鼠腓肠肌张力增加，其肌肉硬度也发生明显增加，说明UE可用来评估脊髓损伤大鼠痉挛腓肠肌的硬度改变。该研究为UE用于评价动物肌张力变化奠定基础。

2.3 速度依赖性踝扭矩和肌电记录

1996年Thompson等[22]评估正常大鼠踝伸肌伸展反射的速度依赖性踝扭矩和相关活动。简而言之，将动物置于限制器中，并将后爪粘贴到由计算机控制的步进电机驱动的金属板上，并且总是与同侧的肌电图(electromyography,EMG)一起测量。在步进电机驱动的踝关节屈曲期间，使用中速、快速和慢速踝关节旋转速度，测量踝关节对背屈的抵抗力。分别在清醒动物和麻醉动物中测量阻力，用清醒时的阻力减去麻醉时的阻力，可以计算出神经源性的相对阻力。此外，可以检测到肌肉阻力的痉挛成分，因为痉挛状态与速度有关。同时记录EMG活性，将一对钨电极间隔1 cm经皮插入腓肠肌，为了检测痉挛状态，仅使用来自快速踝关节旋转测量的EMG数据[23]。

有研究评估在大鼠中慢性鞘内注射GABAB激动剂巴氯芬(intrathecal baclofen pump implantation,ITB)及其停药期间的反射兴奋性和运动改变，结果观察到在ITB治疗4周期间，速度依赖性踝扭矩持续降低；在巴氯芬戒断期间，速度依赖性踝扭矩增加[24]。Bose等[25]使用速度依赖性踝扭矩和肌电记录仪器研究T8挫伤后踝关节伸展反射速度依赖性变化的性质和时间过程，结果表明2个月时在使用这些途径的肌肉伸展反射中有明显的痉挛模式，踝关节扭矩和踝伸肌肌电图振幅显著增加。van Gorp等[26]利用人神经干细胞移植(human fetal spinal cord-derived neural stem cells,HSSC)治疗改善了急性腰脊髓损伤大鼠踝关节旋转期间腓肠肌抵抗力和肌电图活动，证明人神经干细胞移植可以改善痉挛。

2.4 步态分析

Tread Scan步态分析系统和CatWalk装置已被用于评估各种中枢和周围神经损伤模型的静态和动态步态参数(例如爪位置，支撑基部，步长，前肢与后肢协调)。其基本原理为：将一只动物放在玻璃步道上行走，光线从动物的爪子上反射出来，从步道下方可观察到一系列明亮的足迹，通过摄像机记录足迹并分析[27]。CatWalk系统允许实验者在动物穿过走道时计算清晰的步态特征。Tread Scan步态分析系统的皮带驱动跑步机设备提供相同的手动识别步进周期和计算步态特征的能力，但具有速度控制的附加优势。

Beare等[28]研究显示，脊髓损伤后4周以10 cm/s行走的中度脊髓挫伤小鼠，后肢摆动时间变短，后肢轨道宽度相当窄，后肢趾部扩展减少，后肢步幅减少。类似的变化也在脑卒中大鼠模型中被观察到。CatWalk结果显示MCAO模型组大鼠的四肢压强、足接触面积和步行速度均比对照组大鼠减小、减慢[29]。虽然大多数研究是基于探讨大鼠造模后运动功能变化，但不可否认步态的变化与痉挛的发生有着密切的关联。

van Gorp等[26]证明在肌痉挛缓解的同时，步态分析显示，在SCI-HSSC动物中，后肢放置有显著改善，大鼠显示出更好的首尾后爪定位。Harada等[30]在Catwalk系统收集的步态分析参数中，MCAO后印刷区域(前爪或后爪区域)和中间脚趾扩展(指尖距离)显著减少，被认为可能与缺血应激诱导的痉挛状态有关。

与此相似的足迹分析，是将大鼠后肢涂上黑色墨水，让大鼠沿着舷梯走在一张白纸上，然后分析留在纸上的足迹。已经有研究通过测量每只大鼠第一和第五脚趾之间的距离和步幅长度，并与同侧后肢对比，把脑梗死对侧后肢的足趾扩散和/或步长的显著减少作为痉挛标准[31-32]。

3 特殊实验

2006年Smith等[33]开发一种评级系统，称之为路易斯维尔游泳秤(Lovisville Swimming Scale,LSS)，评估游泳的三个特征，即后肢运动、前肢依赖性和身体姿势。数据结果表明，LSS是一种灵敏可靠的方法，用于确定胸椎标准化挫伤后游泳能力和后肢功能的改善。

2017年Ryu等[34]检查了游泳测试和EMG用于评估挫伤性脊髓损伤大鼠模型的痉挛状态的可行性，在脊髓损伤造模后3～6周进行游泳测试，结果表明，游泳测试可以准确评估这种挫伤脊髓模型的痉挛状态，是评估痉挛行为和开发针对脊髓损伤后痉挛状态治疗方法的有效方法。

4 小结

痉挛常常会导致疼痛、关节挛缩、共同运动、步行功能障碍、跌倒等不良事件发生，大大降低了许多类型中枢神经系统损伤后的生活质量[35]。实验动物模型的建立为研究痉挛的机制、发生的生理病理变化和治疗手段的有效性提供了科学的理论基础。动物模型损伤中枢不同部位可模拟不同损伤机制导致的肢体痉挛，痉挛发生后及时发现并做出定量的评定是研究中要解决的关键问题。但是定量测量方法应用还存在一些问题：①UE受检测者操作手法的影响，还与模型鼠脂肪含量、肌肉内是否有钙化等异常病变有关；②步态分析在临床中已经广泛用来分析痉挛，然而在动物模型中大多用来评定运动功能的变化，与痉挛的关系还需进一步研究。