酶联免疫法检测艾滋病抗体的质量控制研究

周 敏 林 哲 王甲芳 刘 萍

（济南市历下区疾病预防控制中心 山东济南 250013）

1 前言

艾滋病是一种危害性极大的传染病，若不及时防治可造成感染者不断增加，威胁人类生命安全。而要防治艾滋病，就需要尽早对高危人群进行艾滋病抗体检测，以明确其抗体阳性和阴性，指导临床采取相应的方案对其进行治疗和处理。酶联免疫法是目前临床检测艾滋病抗体最常用和最有效的方法之一，其虽具有快速有效的初筛效果，但在实际检测过程中，受人为因素、环境因素、试剂因素、仪器因素、内部对照质控血清及外部对照质控血清多方面因素影响，检测结果产生一定偏差。对此，需要积极探寻有效对策，以做好酶联免疫法检测艾滋病抗体的质量控制工作[1]。

2 人为因素

2.1 人员素质

酶联免疫法包含多种检测方法，不同检测方法的原理不尽相同，要完成这些试验检测，不仅要求检测人员具备丰富的免疫血清学相关理论知识和掌握各种酶联免疫法实验原理，同时还需熟练掌握检测仪器的性能及操作方法、检测试剂的性能和各种酶联免疫法检测步骤等，但是，在实际检测过程中，往往有不少检测人员自身专业技能或对自身要求有待提高，对酶联免疫法试验原理理解不透彻、操作过程不严谨，从而对检测结果产生不良影响，进而降低对艾滋病抗体检测的质量[2]。对此，实验室管理人员需要不断强化检测人员的专业技能和综合素质培训，促进其能规范按照酶联免疫法检测流程开展艾滋病抗体检测和处理有关数据，从而提高检测结果的准确性。

2.2 试剂使用

酶联免疫法对试剂盒的特异性和敏感性要求均较高，为减少酶失活，应避免反复冻融，也不可混用各种酶标试剂，试剂开封后，应在规定时间内使用完毕。但在实际使用过程中，不少检测人员并未按上述要求使用试剂。对此，为提高酶联免疫法对艾滋病抗体的检测质量，检测人员在使用试剂前必须进行室温平衡，并确保在试剂的有效期内使用。另外，还需注意观察试剂稀释液中是否出现结晶[3]。

2.3 样品

在检测过程中，若检测人员对患者血样采集和保存控制不当，易导致血样发生污染和溶血等现象，也会对检测结果造成影响，如标本溶血时可释放大量过氧化物酶阳性物质，从而使非特异性显色增加，对测定结果造成一定的干扰。另外，对于一些无法立刻进行检验的样品，检测人员往往会对其行冷冻保存。在冷冻保存后，未待标本完全融化便对其进行检测，也会影响测定结果。对此，就需要检测人员加强样品采样期间的质量控制，如采用带盖的真空管采集血样标本，以避免样品发生污染和溶血，若取样后，无法当天对样品进行检测，需将其置于2～8℃冰箱保存，保存时间最长不得超过一周，对冷冻样品进行检验前，须待其完全融化并充分摇匀后才可使用[4]。

2.4 加样

加样是采用酶联免疫法检测艾滋病抗体过程中的重点和难点，原因在于样品的微量变化便会对检测结果的准确性产生直接影响，且其涉及多次加样，每一项环节出错都会影响测定结果。而在实际检测过程中，有不少检测人员因自身专业技能不足或工作疏忽，往往违背规范步骤进行加样。对此，需要检测人员按酶联免疫法加样步骤进行加样，分别设待测样品孔和空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂）以及阴阳性对照孔和外部对照质控血清孔。加样时，需将样品加于酶标板孔底部，且保证加样器的吸头不触及包被孔的内底部，以免将包被物划掉，从而影响检测结果的准确性[5]。

3 环境因素

实验室环境中的温度变化会对酶联免疫法检测过程和结果造成较大的影响，尤其是试剂的室温平衡、各种酶促反应温度条件及酶标板周围的温度等会对检测结果产生直接影响，但在实际检测过程中，不少检测人员并未意识到环境因素对检测结果的影响，未能合理控制各项环境因素。对此，为提高酶联免疫法对艾滋病抗体的检测质量，就需要检测人员在检测过程中及时关闭仪器仓门，将实验室温度控制在18～25℃，并将全自动酶免仪的温度设定为37℃，恒定温度条件下进行各种酶促反应。另外，还需保证酶标板周围的温度与内部孔一致，才能提高检测结果的准确性[6]。

4 试剂因素

酶联免疫法对试剂的特异性和敏感性要求均较高，排除检测人员自身因素造成的试剂使用不当因素，试剂本身质量的好坏也会对酶联免疫法检测质量造成直接影响。在实际检测过程中，检测人员往往会忽视对酶联免疫试剂质量的筛查，从而影响测定结果的准确性。对此，就需要检测人员在使用试剂前对其质量进行严格检验，确保使用的试剂符合卫生部注册、药品检定所检定及批检合格标准或使用经过国家卫生和计划生育委员会批准鉴定有防伪标志的酶免疫（EIA）检测试剂盒。另外，还需仔细查看试剂的有效期，确保其在有效期内使用，不可使用过期试剂[7]。

5 仪器因素

5.1 移液器

酶联免疫法实验加样量较少，通常需要采用移液器进行加样，若移液器精度不足，将会对实验结果的准确性产生直接影响。这就需要检测人员使用移液器前校准其计量，但在实际检测过程中，检测人员往往未进行该步操作，从而导致艾滋病抗体检测质量不佳。对此，就需要提高检测人员对校准移液器计量精度重要性和相关校准方法的认识及掌握。

5.2 水浴箱

水浴箱温度的高低也会对酶联免疫试剂和样品的反应产生直接影响，虽然大部分水浴箱均配备了温度计，但不少研究均证实，水浴箱温度计所指示的温度与箱内的温度存在一定的误差。对此，就需要检测人员在水浴箱内放置温度计，明确水浴箱温度计所指示的温度与箱内实测温度是否一致，一般允许二者之间存在±1℃的误差，若超过这个误差范围，就需及时校准水浴箱温度计计量，并且还需注意观察水浴箱盖的密闭性。

5.3 洗板机

洗板机工作性能的好坏也会对酶联免疫法检测艾滋病抗体的质量造成影响，若洗板机不能顺畅地流出洗液，则提示其可能发生堵塞现象，从而会对检测的吸光度值造成不良影响。对此，就需要检测人员在使用洗板机之前，对其各项使用性能或功能进行调试，包含洗板机的针头放水高度、吸水高度、加液量、泵的压力、洗涤次数、浸泡时间及检测试剂对洗板机的其他要求等，同时还需观察洗板机洗板管道的气泡及针头的通畅情况，最好进行预洗，以免其发生堵塞现象，且洗涤时各孔均需加满洗液，以免洗涤不充分而引发非特异反应，从而造成花板或假阳性，进而干扰检测结果。使用洗板机后，需及时切断电源并做好洗板机的维护工作，如清洗洗板针孔等，这样才能保证其检测质量。

5.4 酶标仪

酶标仪是酶联免疫吸附试验专用仪器之一，主要采用比色法进行测定分析，检测对象均为体积在250 μL以下的测试液，因此，该仪器对自身计量精度也有较高的要求，若其精度发生轻微偏差，便会影响整个检测结果的准确性。对此，就需要定期对酶标仪进行校准。另外，检测人员还需加强对酶标仪滤光片的维护，避免其发霉而影响测定结果。

6 内部对照质控血清

内部对照质控血清指的是试剂盒内部厂方提供的一套阴阳性对照血清和空白对照，若检测人员不能按厂方提供的内部对照质控血清规范进行试验检测，将会降低检测结果的准确性。对此，就需要检测人员严格按照试剂盒说明书中要求设立的阴阳性对照血清和空白对照作为内部质控，且只能在该批号生产的试剂盒中使用内部对照。

7 外部对照质控血清

外部对照质控血清则是实验室为监控检验试剂盒批间差异及每次检测稳定性、重复性而设置的一套阳性和阴性血清。设置外部对照质控血清能直观体现检测结果的正确性和准确性。

7.1 外部对照质控血清的使用

采用酶联免疫法对艾滋病抗体进行检测的过程中，为提高检测结果的准确性，检测人员首先需选择弱阳性的质控血清开展实验检测对照，并且，还需保证弱阳性质控血清的光密度（OD）值为试剂盒被测分析物量值的2～3倍；其次，对质控血清标定后，需采用小瓶对其进行分装，分装过程中需严格执行操作规范，每一小瓶分装需保证在1周内使用完毕，其余不用的质控血清置于低温冰箱中保存。若冰冻的质控血清融化，则不可对其进行再次冻存，而是要将其存放于2～8℃低温环境中保存，并在1周内使用完毕。

7.2 质控图的制作

为直观地体现检测结果的正确性和准确性，还需根据连续检测20次外部质控血清所得到的光度值，对其平均值、变异系数CV及标准差S进行计算，根据对外部质控品检测结果的均值和标准差来确定控制线，进而绘制质控图。从第21次起，还需在质控框架图中点入每次检测得到的质控血清的光度值，以检验其是否进入质控状态。为促进整个质控结果更加清晰，在制作外部血清质控图的过程中，检测人员还可在质控图中描绘试剂盒内部对照质控血清的光度值，若外部质控血清、试剂厂家及试剂批号等发生改变，还需重新制作新的质控框架图。

7.3 质控图的使用

根据制作的质控图，检测人员还需对酶联免疫法测定的实验结果的准确性进行综合分析：（1）告警：当外部质控品的光度值超出x+2s范围时，系统处于告警状态，应该引起注意；（2）失控：当外部质控品的光度值超出x+3s范围时，系统处于失控状态；（3）漂移：连续几次（3～5次）外部质控品的光度值都落在均值的一侧则称为漂移，提示实验条件发生了较大的变化。总之，出现一次超出3 s范围的变化、连续2次出现同一方向超出2 s范围的变化、连续4次出现同一方向的超出1 s范围的变化、连续10次结果都在1 s范围内，但落在均值线的同一侧等情况时，应暂停检测查找原因。此时，必须找出问题发生的原因，提出解决方法，并消除原因，避免将来出现同样的问题。

8 结语

近年来，世界范围内艾滋病流行形势日趋严峻，新发感染数量不断增多，这就需要艾滋病抗体检测实验室加强艾滋病抗体的检测，以指导临床尽早采取有效方案对感染患者进行治疗和处理，从而预防和降低艾滋病的发生。酶联免疫法具有自动化强度高、检测速度快、有利于大规模筛检等众多优势，但是，在实际检测过程中，受多方面因素的影响，常易影响检测质量。对此，就需要检测人员不断提高自身专业技能和素质，规范做好仪器使用前的校准，严格控制使用试剂质量、试验温度及内外部质控血清等，以提高检测结果的准确性。