诱导性多功能干细胞在皮肤科研究与应用的进展

李遇梅 张怡萱 刘莉萍

江苏大学附属医院皮肤科 镇江市免疫性皮肤病重点实验室，江苏镇江 212000

诱导性多功能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是通过向体细胞中导入一些特定的多能性转录因子使其重编程为干细胞，拥有类似胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）的特征，具有多能分化性［1］。ESC虽然具有全能分化性，但由于它来自胚胎，在应用至细胞治疗时无可避免会存在伦理学争议，另外组织相容性问题也是它应用于临床的另一障碍［2］，而iPSC 可以更少涉及伦理学争议。在适当条件下，iPSC可以向三胚层多种细胞类型分化，其中包括皮肤细胞如成纤维细胞、角质形成细胞和黑素细胞等。利用iPSC 可以构建疾病模型，在体外用于药物筛选。因此，源自患者的iPSC 是研究和治疗不同疾病的理想来源。而且，iPSC可以提供一种将再生医学应用于皮肤领域的新方式，为诸如大疱性表皮松解症、外胚层发育不良等基因相关性皮肤病提供新型干细胞诊疗手段。

一、iPSC的产生与应用概述

继2006年鼠源性成纤维细胞通过病毒法导入特定转录因子而成功重编程为iPSC 后，人源性成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、毛囊外根鞘细胞等皮肤及附属器相关细胞陆续被重编程为iPSC［1］。重编程的iPSC具有以下特征［2-3］：①形态类似ESC，如细胞呈紧密的扁平克隆样生长，具有清晰的圆形边缘，细胞核突出并具有较高的细胞核质比；②核型表达正常；③表达多能性基因及蛋白；④在表观遗传学方面，重编程因子被认为激活了转录因子网络，使八聚体结合转录因子4 和NANOG 基因启动子序列去甲基化；⑤体内畸胎瘤形成实验证明，iPSC可以向内胚层、中胚层和外胚层分化。

iPSC 转录因子最初是将可以诱导ESC 并维持多能性的24 个基因作为候选基因用于重编程，最后确定4个关键基因作为转录因子，用于转染体细胞，能够产生类似于ESC 的细胞，分别是OCT4、SOX2、KLF4 和c-MYC。用相似或其他家族的因子来代替上述重编程因子也可成功进行重编程［4］。基于MYC 家族与多种肿瘤发生发展密切相关，为了临床使用的安全性，研究者尽量不用c-MYC，仅单独利用同源域蛋白或OCT4 导入体细胞得到iPSC［5］。

理论上，经过多能性及表观遗传学验证的iPSC在体外能够向3个胚层多种细胞分化，并且iPSC在体外培养时具有强大的增殖能力，能够提供研究所需的细胞数量。另外，通过体外诱导iPSC 能够获得模拟胃肠道、角膜、皮肤、大脑等的多种类器官，这些类器官具有高度模拟体内组织结构和功能的特性，为研究器官发育和疾病发生提供了细胞模型和动物模型无法替代的工具，具有很好的应用价值。如基于iPSC技术和新型生物材料在体外建立的心脏三维组织模型，能够模拟心脏早期发育过程［6］。iPSC 因为可以提供大量带有疾病特征的细胞而成为用于建立药物筛选模型的最佳选择。有学者用肌萎缩侧索硬化症患者的细胞制备iPSC，并建立一种运动神经元模型［7］，发现该病的发生与Src/c-Abl通路异常有关，两种免疫抑制剂西罗莫司和博舒替尼（bosutinib）合用可以在一定程度上恢复肌肉收缩力，减轻患者痛苦。另外，脊髓小脑共济失调患者的皮肤细胞也可被重编程为iPSC，并将其分化成为“浦肯野细胞”，利用分化的细胞在体外模拟疾病发生过程，发现甲状腺释放激素与利鲁唑可以阻止疾病发展［8］。由此可见，iPSC不仅解决了构建疾病模型的细胞来源问题，并且能够为患者提供个体化模型，进而精确分析疾病发生机制，并选择有效药物。

此外，利用iPSC 生成移植所需细胞用于再生治疗，目前已经进入临床试验阶段。2017年，日本理化研究所、大阪大学等多团队合作完成世界首例自体iPSC 来源的色素视网膜移植手术［9］，随访25个月未发现异常反应，且移植1年后患者感觉视野较前明亮，光学相干断层扫描图像显示视网膜完整性良好，并具有高密度区域，表明感光细胞在不断恢复。同时，为了储存可以应用于临床的iPSC，全球人群HLA 配型的iPSC 库也在建设中，一旦成功将加速再生医学的发展，给无数需要进行移植治疗的患者带来福音。

二、iPSC在皮肤疾病中的应用

1.iPSC 转化为皮肤：患者来源的iPSC 在细胞和基因治疗方面都显示出显著优势。利用iPSC治疗皮肤疾病，需要将其有效分化成为皮肤的主要细胞即角质形成细胞和成纤维细胞。2015 年，Gledhill等［10］将正常人来源的iPSC在体外成功定向分化为这两种细胞以及黑素细胞，为iPSC 应用于皮肤科奠定了基础。Yang等［11］将iPSC分化成为存在于毛囊隆突部位、影响毛囊生长和循环的上皮干细胞，这些细胞具有生成所有毛囊谱系（包括毛干、内毛根鞘和外毛根鞘）的能力，进而以此重建毛囊的上皮成分和滤泡间表皮。上述由iPSC分化而来的皮肤细胞及附属器相关细胞可以用于研究和治疗伤口愈合和其他退行性皮肤病，并且为脱发提供组织工程学新疗法。

Gledhill等［10］在将iPSC成功在体外分化成角质形成细胞和成纤维细胞的基础上，先开发出基于两种细胞的三维皮肤等效物，证明iPSC 可以成功为皮肤建模，此后又通过添加iPSC 衍生的黑素细胞增加模型复杂性，并发现黑素可在iPSC 衍生的黑素细胞和角质形成细胞之间转移。但这种三维皮肤等效物仍存在一定局限性：第一，它尚未进行体内移植，未证明其是否能适应体内环境；第二，这种三维皮肤等效物无法真正模拟人类皮肤复杂性，它们通常包含很少的细胞类型，并且没有添加皮肤附属器如毛囊、皮脂腺等。

Kim等［12］将脐带血单核细胞重编程为iPSC，通过形成拟胚体定向分化为成纤维细胞和角质形成细胞，并利用这两种细胞构建三维皮肤类器官，最后通过束缚敷料，将三维皮肤类器官移植进入免疫缺陷小鼠皮下，并成功维持2 周。Umegaki-Arao等［13］将大疱性表皮松解症（EB）患者iPSC分化的角质形成细胞构建的三维皮肤类器官移植到小鼠体内，但并未说明维持时间。Koehler 等［14］早前开发了一种三维鼠源ESC培养模式，可以产生颅表面上皮（一种皮肤表皮的前体组织），在培养过程中，还产生了异质的间充质细胞和神经细胞群；利用此项技术，他们又在体外的三维培养体系中培养鼠源性多能干细胞（包括ESC 和iPSC），建立皮肤类器官，并表明皮肤类器官在模拟正常胚胎毛囊发生过程中可自发地产生新生毛囊［15］。这种皮肤发育的体外模型将有助于研究毛囊诱导机制，评估抑制或促进毛发生长的药物和模拟皮肤病的发生。2016 年，有学者利用iPSC 制备的三维皮肤器官系统（integumentary organ system，IOS）研发出一种新型体内移植模型［16］，称为聚类依赖性拟胚体移植方法，他们首先探索出iPSC 移植体内诱导生成各种上皮胚层的培养条件，发现Wnt信号通路可以影响IOS 移植物的毛囊生长数量；将IOS 经过原位移植进入裸鼠后背皮下，证明IOS 具有完整功能性，可以与周围的宿主组织如表皮、竖脊肌和神经纤维正常连接，且无肿瘤发生，三维IOS 系统中的生物工程毛囊也显示出正常的毛发生长周期，这项研究利用iPSC初步实现了器官替代疗法的目标。

2.iPSC构建皮肤疾病模型：尽管通过活组织体外培养可以得到患者的皮肤细胞用于构建皮肤疾病模型，但这些细胞在体外增殖能力降低，且低龄患儿活组织检查较难操作。患者来源的iPSC具有无限增殖能力，并可以多向分化，通过基因修正技术还可纠正引起疾病的原位基因突变，因此成为构建皮肤疾病模型的最佳细胞来源，特别是基因变异相关的遗传性皮肤疾病。

EB是由于编码皮肤表真皮连接成分的基因突变而造成的一组重症遗传性皮肤病，目前没有十分明确有效的疗法。对于重症EB 患者，表皮再生及修正突变基因十分必要。Umegaki-Arao 等［13］将EB患者皮损来源的iPSC成功分化为角质形成细胞，并在体外建立带有COL17A1（collagen ⅩⅦalpha-1）基因突变的EB模型；由EB患者非皮损部位的皮肤细胞重编程为iPSC进而分化得来的角质形成细胞并不携带基因突变，利用这种细胞制备皮肤等效物并进行小鼠皮肤移植，可为今后EB 移植治疗提供新方法［13］。营养不良性EB是由于COL7A1基因突变所致，隐性营养不良型EB（RDEB）是其中病情较为严重的表型之一。Itoh 等［17］利用逆转录病毒法将RDEB患者来源的成纤维细胞重编程为iPSC，分化为角质形成细胞后建立三维皮肤类似物，成功构建RDEB 疾病的体外模型。另外，Matsumura 等［18］利用非整合性的仙台病毒载体法将RDEB 患者的角质形成细胞重编程为iPSC，为后续RDEB安全建模提供条件。

外胚层发育不良是一组影响各类外胚层组织（如神经、皮肤等）发生发育的先天性疾病，其中外胚层发育不良性唇裂（ectodermal dysplasia and cleft lip/palate，EEC）由控制表皮发育和维持细胞活动动态平衡的p63基因单点突变引起，EEC综合征包括皮肤缺陷和角膜缘干细胞缺乏症。有研究者将携带p63 基因结构域中两位点突变的EEC 患者的成纤维细胞重编程为 iPSC［19］，发现这种 iPSC 可以分化成早期外胚层标志物K18+细胞，但无法进一步分化成K14+细胞（表皮/角膜缘）或K3+/K12+细胞（角膜上皮）；APR-246 是一种能够恢复突变型p53功能的小化合物，添加APR-246培养后可以使EEC患者来源的iPSC 向角膜上皮细胞分化，并恢复正常的p63相关信号通路，该研究利用EEC患者来源的iPSC 模拟疾病，并为未来EEC 治疗药物筛选铺平了道路。

3.iPSC 应用于皮肤疾病细胞/基因治疗：来自患者的iPSC 携带患者自身信息，可以提供治疗所需的各种自体细胞类型，在移植治疗时不但避免了自身免疫排斥反应，还避开了伦理争议。Itoh等［17］为了进一步研究RDEB的细胞治疗方案，将iPSC分化为真皮成纤维细胞，该细胞可以产生Ⅶ型胶原蛋白，成为具有治疗RDEB 的潜力细胞之一。目前EB 的基础治疗研究包括同种异体间充质干细胞（mesenchymal stem/stromal cell，MSC）移植法［20］。MSC是一类基质干细胞的异质群体，可以通过细胞分化和释放旁分泌因子对伤口愈合起作用，并且MSC能在体内促进Ⅶ型胶原蛋白分泌［21］，但获取供体骨髓中的MSC 对患者损伤较大，因此可以利用患者来源的iPSC 分化为MSC 进行治疗，减少对患者的伤害；Nakayama 等［22］以仙台病毒为载体将RDEB患者的角质形成细胞重编程为iPSC，将其在体外分化成MSC，然后皮下和静脉注射至全皮肤损伤的免疫缺陷小鼠体内，2周后观察到小鼠皮肤出现再上皮化，证明由iPSC 分化而来的MSC 也具有修复伤口的能力。另外，Tolar等［23］发现RDEB患者水疱部位皮肤细胞有编码Ⅶ型胶原蛋白的COL7A1 基因突变，而无水疱部位皮肤细胞则无突变，他们将无突变的皮肤细胞称之为自发性基因修正细胞，并重编程为iPSC，再分化成角质形成细胞，以此建立的体外皮肤模型可以正常表达Ⅶ型胶原蛋白，这种方法为在RDEB和其他疾病患者中使用自发性基因修正细胞进行自体细胞治疗奠定了基础。

如前所述，iPSC是可以靶向纠正基因突变的有效工具细胞，这种细胞基因修饰疗法为皮肤病的治疗提供了新视野。Wenzel等［24］为了证明iPSC可应用于RDEB 的治疗，研发出带有RDEB 疾病特征的COL7A1 基因突变小鼠，获得其iPSC，再利用Flpo技术将iPSC 进行基因修复，遗传修复的iPSC 可以分化为功能性成纤维细胞，重新表达并分泌Ⅶ型胶原，移植到RDEB 小鼠体内后通过荧光素追踪至16周，结果显示，小鼠表真皮连接处不但恢复了Ⅶ型胶原沉积，还恢复了RDEB小鼠皮肤对起疱的机械抵抗力。几乎同时，有学者制备RDEB患者经基因校正的角质形成细胞皮肤片用于移植［25］，即利用腺病毒介导的传统基因组编辑方法靶向修复RDEB 患者来源的 iPSC 的 COL7A1 基因突变，以产生校正的iPSC，由其分化的角质形成细胞异质性较小，并分泌Ⅶ型胶原，在体外类器官培养和小鼠移植实验中都能形成分层表皮。此后，Shinkuma等［26］改进基因编辑方法，利用内转录激活因子效应物核酸酶和成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白9技术，对显性营养不良性EB 患者来源的iPSC 进行基因编辑，经过分选，90%的iPSC被成功编辑，这些iPSC可以分化成分泌Ⅶ型胶原蛋白的角质形成细胞和成纤维细胞，这项研究通过iPSC证实突变位点特异性基因组编辑在显性失活疾病中运用的可行性。

三、小结与展望

目前，iPSC技术在细胞替代疗法和基因靶向治疗等方面都表现突出，但将iPSC 衍生的皮肤细胞应用于临床，还面临着几个重要的问题，即①治疗有效性：这意味着不但要获得大批高质量可供移植的细胞，并且这些细胞还要耐受移植环境，可以应对应激、衰老等情况而维持持久的功能性，这些都需要进一步对iPSC 来源的移植细胞进行验证；②基因稳定性：2014 年有日本学者将由iPSC 来源的视网膜色素上皮细胞移植给黄斑变性患者［27］，但由于移植细胞中有2个微小基因突变，临床试验被叫停，如何维持分化细胞的基因稳定性是将iPSC技术应用于临床的关键；③免疫原性：iPSC 技术要被大规模应用于临床，就需要建立同种异体的iPSC库，如前文所述这项工作已在进行中，在这种情况下，降低异体细胞的免疫原性，精确地进行HLA配型就显得十分重要。此外，对于iPSC 存在形成肿瘤风险的质疑从未消失，但iPSC 在分化过程中干性基因相继沉默，目的细胞的特征性基因上调，细胞命运发生改变，从目前的临床移植试验来看，iPSC分化的细胞并无形成肿瘤的风险。

尽管面临困难，但iPSC 凭借其独特优势依然给皮肤疾病的治疗和研究带来深远影响。目前iPSC 技术显然已成为遗传性皮肤病的一种新型靶基因治疗工具。另外，iPSC分化细胞若能保持基因稳定性，针对一些重度烧伤或瘢痕疙瘩等无法从健康区域大量扩增表皮细胞的患者，也将具有很大的移植优势。总之，iPSC技术将加速再生医学在皮肤疾病中的应用，为皮肤再生医学的发展作出贡献。

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