绝经后骨质疏松症相关的LncRNA研究进展

陈桐莹 万雷 刘少津 柴爽 林燕平

1.广州中医药大学第三临床医学院，广东 广州 510405 2.广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510375

骨质疏松症是一种临床较为常见的全身性骨骼疾病，可分为原发性与继发性两种类型，绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是原发性骨质疏松症中最常见的一种，又称I型骨质疏松症。据预测，从1997年到2050年，中国的骨质疏松症人群将从8 390万急剧攀升至2.12亿[1]。由于PMOP是一种慢性代谢性疾病，严重影响绝经后妇女的身心健康，给她们及家庭带来沉重的负担。因此研究绝经后骨质疏松症的发病机制和探索其防治手段就显得非常重要。传统观点认为PMOP的基本发病机制涉及破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成之间的不平衡，主要是由于雌激素水平下降，继发甲状旁腺功能亢进，降钙素分泌不足，从而导致骨吸收大于骨形成[2]。近年来，越来越多的研究认为遗传因素、肠道菌群失调、氧化应激和骨髓间充质干细胞(bone marrow messenchymal stem cells, BMMSCs) 异常分化等也是绝经后骨质疏松症发生的主要机制[3]。此外随着对长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA，LncRNA)研究的深入，发现这些LncRNA在绝经后骨质疏松症中起着重要作用。本文将针对近年来与PMOP相关的LncRNA展开综述。

1 LncRNA的作用机制及生物学特性

2002年日本学者Okazaki在对小鼠cDNA文库进行测序时，第一次发现并鉴定了一类较长的转录产物，将其命名为LncRNA[4]。它是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，主要来源有：①编码蛋白质的基因结构发生中断产生；②染色质重组；③非编码基因复制过程中的反移位产物；④局部的串联复制子中产生；⑤基因组中插入一个转座成分而产生有功能的非编码RNA。而根据其在基因组上相对于蛋白质编码基因的位置，LncRNA分为以下几种：①反义长链非编码RNA；②内含子非编码RNA；③基因区间的非编码RNA；④启动子相关LncRNA；⑤非翻译区LncRNA。另外，LncRNA可通过以下方式对基因进行调控：①表观遗传调控(基因组印记和X染色体失活)；②转录调控(LncRNA的转录可以干扰邻近基因的表达，还可以作为共因子调节转录因子的活性)；③转录后调控。近年有大量研究[5]表明LncRNA在多种疾病发生、细胞周期、干细胞分化等生物进程中发挥着作用。在成骨分化过程中，也证实了分化的间充质干细胞中超过100个LncRNA被上调或下调;在对骨质疏松的研究中发现，LncRNA在Wnt/β信号通路、PI3K-Akt信号通路、BMPs/TGF-β信号通路、Notch信号通路和Hedgehog信号通路中能促进成骨细胞的分化,而在RANK/RANKL/OPG 通路、MAPK通路、PPAR-γ通路能抑制破骨细胞的分化。可见LncRNA在骨质疏松症等骨代谢疾病的发生中起着重要作用。

2 LncRNA调节成骨细胞的分化

2.1 MEG3、DANCR和BDNF通过表观遗传调控调节成骨细胞分化

LncRNA 可以通过表观遗传调控影响成骨分化，即可通过DNA甲基化或去甲基化、RNA干扰、组蛋白修饰、染色体重塑等，在表观修饰水平调控基因的表达。MEG3位于染色体14q9上，对于正常生长和发育很重要，其是一种特定的肿瘤抑制因子，功能是激活p53并抑制细胞增殖，并可以控制印迹基因表达。在LncRNA MEG3的早期研究[6-7]中发现其在某些癌症中特异性地低表达。Zhuang等[8]研究成骨细胞分化过程中的MEG3功能，发现MEG3敲低可以靶向BMP4转录进而抑制间充质干细胞(mesenchymal stem sells,MSCs)的成骨分化。敲低MEG3会显著降低关键成骨标志物Runt相关转录因子2、Osterix和骨钙素的表达，过表达MEG3则会增强它们的表达；MEG3还可以通过从骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)4基因中解离SOX(sry-related HGM-box)2来阻断关键转录因子SOX2对BMP4启动子的激活。BMP4是转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)家族的成员，被认为是软骨和骨形成的调节因子，并且其在胚胎发育、造血，组织和细胞分化增殖以及间充质干细胞发育中起非常关键的作用。Zhuang的实验显示了LncRNA MEG3可能通过控制邻近编码基因BMP4的转录调控间充质干细胞的成骨分化。Chen等[9]在BMMSCs中发现了LncRNA MEG3的一种抑制剂DEPTOR，并发现其能通过抑制MEG3介导的BMP4信号传导活化来调节成骨分化，参与骨质疏松症的发生。此研究结果也证明了MEG3介导的BMP4信号传导可以正向调节成骨分化这一过程。

Zhu等[10]发现DANCR能抑制成骨分化，其通过募集 EZH2至Runx2基因启动子，催化甲基化，导致Runx2及成骨分化被抑制。LncRNA-DANCR位于人4号染色体上，最接近的相邻注释基因位于USP46上游54.8 kb和ERVMER34-1 ANCR基因座下游28.7 kb。与蛋白质编码相比，DANCR是非编码转录物的可能性是7.64×1090倍。DANCR参与了祖细胞的分化。此外，DANCR调节成骨细胞分化，是成骨细胞分化的重要介质[11]。而Xiang等[12]在探索LncRNA与人类骨质疏松症相关的循环单核细胞中的作用的实验发现，DANCR在有骨吸收活动循环单核细胞中能促进IL-6和TNF-α的表达。首先，循环单核细胞直接参与破骨细胞生成，它们是破骨细胞的前体，并且还分泌骨诱导因子，例如IL-1、IL-6和TNF-α[13-14]。其次，细胞因子IL-6可以促进造血和破骨细胞生成，骨和骨髓基质细胞产生的IL-6在体外被17β-雌二醇抑制。因此，雌激素的损失导致IL-6介导的破骨细胞生成刺激，这也是绝经后骨质疏松症中骨吸收增加的机制[15]。另外过度表达人类TNF的转基因小鼠除了糜烂外还会发生全身性骨质流失和骨质疏松症[16]。由此可知DANCR可能在骨质疏松症的病理机制中发挥重要作用。

反义LncRNA可以通过招募形成染色质修饰复合物而沉默邻近基因转录，例如BDNF。Xiao等[17]在卵巢切除(OVX)小鼠的实验中发现OPN和Runx2(两者均为成骨标志物)被长链非编码RNA BDNF-AS(脑源性神经营养因子-反义转录物)下调，而被BDNF上调。Xiao等评估了在成骨分化期间OVX衍生的BMMSC中BDNF-AS的动态变化，发现BDNF基因和蛋白的下调支持了BDNF-AS和BDNF在成骨分化中是错综复杂且反向相关的。OPN和Runx2的下调可能有助于解释BDNF-AS上调抑制或降低BMMSCs的成骨分化。该实验证明了BDNF在调节BMMSC的分化中起着重要作用，同时还发现了一种新的信号通路BDNF/BDNF-AS，它参与了BMMSCs的成骨分化。

2.2 H19通过竞争性内源RNA促进成骨细胞分化

LncRNA可通过竞争性结合有限的miRNA特定位点控制其他RNA包括编码 RNA的水平。因此学者们提出了竞争性内源性RNA的假说，认为mRNA、假基因转录物、LncRNA等转录物与miRNA具有相同的应答元件(miRNA responseelement，MRE)，通过竞争性结合同种miRNA来调控各自的表达水平，从而影响细胞的功能。LncRNA-19位于人类11号染色体上，H19是最著名的印记基因之一，仅从母系遗传的等位基因转录。Huang等[18]在研究H19/miR-675在人间充质干细胞(human mesenchymal stem sells，HMSCs)成骨分化中的作用和功能的实验中证明H19是细胞水平成骨分化的正向调节剂。Huang等还发现H19可通过转化生长因子(TGF)β1/Smad3蛋白/组蛋白(HDAC)信号通路来促进HMSC的成骨分化。随后，Fu[19]证明H19可通过竞争性内源RNA促进成骨细胞分化。最近，Li等[20]研究H19在废用性骨质疏松症(disuse osteoporosis, DOP)发病机制中的生物学功能时发现敲低H19能抑制Wnt信号传导和成骨功能，这与H19可能干预Wnt/β连环蛋白信号传导途径(Wnt信号)，从而发挥调节骨形成和参与成骨细胞分化有关。Li等的研究为H19正向调节成骨功能提供了实验证据。他们还进一步研究发现了Dkk4是H19的潜在靶向基因，研究中H19的表达减少会促进Dkk4表达。而Dkk家族(Dkk4)已报道在成骨细胞中发挥负向调节作用，Dkk4在成骨细胞中可以抑制Wnt信号传导。此发现亦可间接证明H19可促进成骨分化。

2.3 MEF2C在转录后水平调节成骨分化

肌细胞增强因子(musculocyte enhancement factor, MEF)2家族转录调节因子MEF2C在成熟的骨髓和外周成熟B细胞中高度表达[21]。MEF2C的遗传缺失会削弱软骨血管生成、骨化和纵向骨生长。相反，超活化的MEF2C则能导致早熟的软骨细胞增生、生长板的骨化[22]。MEF2C-AS1是一种反义LncRNA。Qin等[23]通过研究单个LncRNA多态性，发现MEF2C-AS1 rs6894139与FN(股骨颈)骨密度(bone mineral density, BMD)相关，而LOC100506136 rs6465531与HIP(腰椎和全髋)BMD相关。Li等[24]发现小鼠BMD定量性状基因座定位于MEF2C-AS1区域。信号、诱饵、导向、框架是LncRNA生物学效应的形式，以上实验可证明LncRNA MEF2C-AS1可影响MEF2C表达或翻译，特别是其二级结构间接影响软骨内骨发育。这些研究发现意味着MEF2C-AS1 rs6894139、LOC100506136 rs6465531在骨代谢中的潜在作用，为绝经后骨质疏松症提供了更多的研究方向。

2.4 LINc00963、LOc105376834、LOc101929866、LOc105374771和LOc100506113

随着技术的进步，从单个基因位点的分析已经扩大到LncRNA与mRNA的网络构建分析。Qi等[25]在骨质疏松患者的RNA 测序研究中发现了差异表达的LINc 00963、LOc105376834、LOc101929866、LOc105374771和LOc100506113明显下调，他们建立了EnncRNA-DEmRNA共表达网络，此表达网络能反映出LncRNA与mRNA之间的正相关性。同时检测到差异表达的mRNA碱性磷酸酶(ALPL)、细胞因子信号转导抑制因子3(SOcS3)、肾上腺髓质素(ADM)、分泌性白细胞肽酶抑制剂(SLPI)和CD177均明显下调。在下调的LncRNA中，LOc105374771是最显著下调的LncRNA，其与130个dEmRNA共表达，包括ALPL、SOCS3、ADM、CD177和SLPI。故LOc105374771可能通过调节这些dEmRNA的表达来影响PMOP的发病。已知ALPL是一种成骨细胞标志物，下调的ALPL可以反映成骨细胞活性降低、骨形成和细胞外基质矿化。以往的研究也已经检测到PMOP患者和卵巢切除小鼠骨组织样本中的ALPL下调。而SOCS3升高转化生长因子-β、TNF-α和RANK配体(RANKL)诱导的破骨细胞形成，并通过抑制剂促进破骨细胞谱系的前体。SOCS3还通过调节相关细胞来参与RANKL介导的树突细胞衍生的破骨细胞生成。ADM与调节骨形成密切相关。可以在体外促进软骨细胞和成骨细胞的生长[26]。此外，ADM可以减少血清饥饿的成骨细胞中的凋亡细胞死亡。CD177是PMOP中第三个重要的DEmRNA，也可能是雌激素相关基因。由此可以得出，LINc00963、LOc105376834、LOc101929866、LOc105374771和LOc100506113与以上五种DEmRNA的共同表达可能提示这些差异表达的LncRNAs参与了PMOP的发病。

3 LncRNA调节破骨细胞的分化

3.1 LncRNA AK077216通过转录调控促进破骨分化

LncRNA可以依赖与靶基因的相对位置及序列特点，如通过将转录调控因子募集到邻近的靶基因启动子上的方式，在转录水平上调控靶基因的表达。Liu等[27]在LncRNA AK077216对破骨细胞生成和骨吸收作用的实验中发现，LncRNA AK077216 促进了破骨细胞分化并增强破骨细胞骨吸收。具体通过抑制活化T细胞核因子蛋白(nuclear factor of activated T cell interacting protein，NIP)45并提高NFATc1的表达来促进RANKL诱导的破骨细胞生成和骨吸收。核因子κB配体(RANKL)可以通过激活MAPK和NF-κB途径诱导破骨细胞生成转录因子(c-Fos和NFATc1)的表达,进而影响破骨细胞的分化。而活化的NFATc1反过来可以调节破骨细胞特异性基因的表达，例如编码抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、基质金属蛋白酶和组织蛋白酶K(CTSK)的基因，这些基因参与破骨细胞骨吸收[28]。故NFATc1是破骨细胞生成过程中的一种必需的转录因素。而在先前的实验中[29]发现在RANKL刺激的前破骨细胞中敲低NIP45的表达会增加NFATc1、NFATc2和TRAF6的水平，这表明NIP45通过抑制NFATc1表达负调节破骨细胞分化和骨吸收。Liu等的实验中生物信息学分析表明NFATc1和NIP45可能还具有负调控关系。由此发现了Lnc-AK077216作为一种调节破骨细胞形成和功能的LncRNA，同时抑制破骨细胞前体细胞凋亡，为开发由破骨细胞骨吸收活性变化引起的各种骨科疾病的新疗法提供了新思路。

3.2 LncRNA LINC00311通过Notch信号通路影响破骨分化

当Notch信号通路增强，骨质疏松症患者骨细胞的增殖和分化可能增加[30]。Delta-like 3(DLL3)是目前仅在哺乳动物中被鉴定的位于Notch信号通路中的分歧配体和调节剂，其表达的变化与成骨诱导有关，还能够通过Notch2促进破骨细胞生成[31-32]。DLL3还是一种脊柱发育不良/矮胖基因，其突变可能导致轴向骨骼缺陷和脊柱骨质疏松症[33]。Wang等[34]通过实验研究LncRNA LINC00311与Notch信号通路及DLL3三者之间的关系，发现LncRNA LINC00311通过Notch信号通路靶向影响DLL3，促进骨质疏松大鼠破骨细胞的增殖和分化，实验证明了LncRNA LINC00311靶向调控DLL3。当LncRNA LINC00311上调时，DLL3表达下降，而下调的DLL3可以通过激活Notch信号传导途径来促进破骨细胞的增殖和分化，同时抑制破骨细胞的凋亡。Notch信号通路的发现有助于促进对骨质疏松症机制的现有理解，并有可能作为未来治疗骨质疏松症的预后标志物。

4 LncRNA调节细胞信号通路的激活

骨代谢的平衡有赖于骨形成与骨吸收的协调统一，这一过程既需要细胞间的信息交流，也需要细胞内多条通路的交互作用及信号转导。既往针对骨代谢的研究已发现多条通路，如Wnt/β-catenin通路、MAPK通路、Toll样受体通路等可以被自分泌或旁分泌的信号分子如Wnt蛋白、硬化蛋白以及雌激素、糖皮质激素等激活或抑制。近年来研究[35]发现LncRNA可以作为信号分子参与信号通路对细胞生命进程的调控。例如LncRNA-H19通过直接激活Wnt/β-连环蛋白途径来增强骨生成[19]；H19下调可通过抑制ERK信号传导而抑制骨形成[36]；LncRNA LINC00311可通过Notch信号通路靶向影响DLL3促进骨质疏松大鼠破骨细胞的增殖和分化[34]。而最近Tang等[37]使用定制的微阵列在成骨分化的第0天和第10天确定了BMMSC中的LncRNA表达谱,并确认了一个新的成骨相关的LncRNA(LncRNA-OG)，此基因在成骨分化过程中被上调，并显示LncRNA-OG在体外显著促进BM-MSC骨生成。LncRNA-OG与异质核核糖核蛋白K(hnRNPK)蛋白相互作用可以调节骨形态发生蛋白(BMP)信号通路激活,hnRNPK通过促进LncRNA-OG启动子的H3K27乙酰化来正向调节LncRNA-OG转录活性。这种新的LncRNA对BM-MSC成骨分化具有积极作用，Tang等还提出了hnRNPK和LncRNA-OG相互作用可以调节骨形态发生蛋白(BMP)信号通路激活并促进成骨分化的观点。另外Li等[38]发现LncRNA-Bmncr通过维持细胞外基质蛋白纤维调节素(FMOD)和BMP2通路的激活来调节BMSCs的成骨分化Bmncr，它在衰老过程中可以调节BMSCs的命运。Bmncr(Bmncr-KO)缺失的小鼠显示骨量减少和骨髓脂肪堆积，而Bmncr(Bmncr-Tg)的转基因过表达减轻了骨丢失和骨髓脂肪积累。且有进一步的分析表明，Bmncr可作为促进TAZ和ABL相互作用的支架，从而促进TAZ和RUNX2/PPARG转录复合物的组装，促进成骨和抑制脂肪生成。这些研究将为防治绝经后骨质疏松症提供一种新方法。

5 展望

绝经后骨质疏松症是一种全身代谢性骨病，由体内雌激素水平降低引起，会极大地影响老年女性的生活质量，国家也需要投入大量的防治费用。笔者认为，对绝经后骨质疏松症的预防和靶向治疗是可行的一种防治思路，而LncRNA是机体中一个庞大复杂的调控网络体系的一部分，其主要是通过对相关基因、蛋白和信号通路的相互作用、相互影响参与各种生理病理活动。可以通过深入研究LncRNA对疾病的精确调节机制，为骨质疏松症等代谢性疾病的诊治寻找新的治疗靶点。而且现有研究对LncRNA的探索已经扩大到对miRNA、mRNA与LncRNA的网络关系研究层次，研究水平也慢慢从细胞和动物实验转移到临床研究。笔者认为在对绝经后骨质疏松症相关LncRNA的研究中，可以从核酸、蛋白、信号通路等方面找寻目标LncRNA所参与的分子生物调控网络，有针对性地进行精确干预，为绝经后骨质疏松症的防治提供一种新的科学的解决方法。