杜氏肌营养不良症治疗研究进展

杨一娴 李昌盛 王蓓蕾 党素英

1.上海交通大学医学院，上海 200025；2.上海交通大学医学院生物化学与分子细胞生物学系，上海 200025

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种全身肌肉呈渐进性损伤和运动功能减退的致死性X 连锁隐性遗传病。患儿多于3～4岁出现步态异常，10～12岁逐渐丧失行走能力，最终在20～30岁死于心肺功能衰竭。男婴发病率为1/3500，我国每年有400～500例DMD 男婴出生，累计患者7万～8万人，是世界上该病患者人数最多的国家之一。该病发病原因是位于Xp21.2-p21.1的编码抗肌萎缩蛋白（Dystrophin）的DMD 基因突变，导致Dystrophin 蛋白在肌细胞膜上缺失，患者肌细胞变性、坏死继而脂肪结缔组织增生。DMD 基因突变类型有多种，大片段缺失占60%～65%，大片段重复占5%～10%，点突变、小片段缺失和重复占25%～30%。虽然目前尚无非常有效的治疗方法，但随着对DMD 的发病机制和病理变化过程愈渐深入的认识，对其治疗的研究与相关临床试验有了很多新的突破。本文对DMD 近年来相关研究进展综述如下：

1 治疗方法

1.1 对症治疗药物

Dystrophin 蛋白缺失会导致一系列病理变化，包括肌肉萎缩、炎症、钙过载、氧化压力、组织缺血等。针对这些病理变化过程的相关药物治疗可以使所有患者获益。

1.1.1 激素 激素是目前认为能够减慢DMD 患者肌力和运动功能衰退的唯一药物，长期每日服用糖皮质激素能明显延缓患者病情进展。它的作用机制主要是通过抑制NF-κB 通路抑制炎症，激活钙调磷酸酶NFAT通路抑制肌坏死。目前强的松和强的松龙是最常用的激素治疗药物，美国FDA 批准的地夫可特也可以用于DMD，且副作用更小[1]。近年来正在研发温和激素Vamorolone（VBP15），相对于传统激素，能以更小的副作用获得同等疗效[2]。

1.1.2 其他针对NF-κB 的药物 脂联素和NEMO 结合结构域（NBD）的小分子模拟物可以降低NF-κB 的活性（已在DMD 疾病小鼠mdx 小鼠和肌营养不良症金毛猎犬中表现出更好的治疗效果），减少炎症，促进肌肉再生，有望成为治疗DMD 新的方法[3]。Edasalonexent（CAT-1004）也是NF-κB 核因子抑制剂，二期临床实验结果显示，服用该药物的DMD 患者运动功能得到一定改善，且未发现安全问题[4]。目前该药物正在进行三期临床实验。

1.1.3 调节肌肉细胞中钙水平的药物 DMD 的病理特征之一是钙调节异常而造成肌肉损害，因此调节肌肉细胞中钙含量能够减缓DMD 疾病的发展。Poloxamer188 NF 能封闭肌肉纤维损害后留下的微孔，阻止钙渗透，有效改善横膈膜的功能，改善呼吸功能[5]，该药物目前正在进行二期临床实验。Omega3能够显著降低心脏和肌肉中总钙水平，对DMD 疾病晚期患者有一定的缓解作用[6]。另外，AT-300通过阻断钙通道[7]，BGP-15促进肌质网膜钙ATP 酶（SERCA）功能都能调节细胞中钙含量[8]，减缓DMD 疾病的进展。

1.1.4 促进肌肉生长 Myostain 蛋白能够限制人体肌肉过度生长，因此抑制这种蛋白表达可以增加肌肉生长，起到治疗作用。BMS-986089、Domagrozumab 都是正在开展相关临床实验的Myostain 蛋白抑制剂，到目前为止，患者耐受性较好[9]。组蛋白脱乙酰酶能通过改变细胞内DNA 的三维折叠影响基因的表达活性，影响肌肉细胞再生能力和收缩功能，也会促发炎症。DMD 患者中该酶水平高于正常人，因此抑制该酶的药物Givinostat 可以促进患者肌肉生长，目前该药物已进入三期临床实验[10]。utrophin 蛋白的结构和功能与抗肌萎缩蛋白相类似，出生后会被抗肌萎缩蛋白代替，只保留在神经肌肉接头处。Ezutromid 能够增加utrophin蛋白的表达，弥补患者肌肉中抗肌萎缩蛋白的不足，达到治疗目的。二期临床实验结果已显示该治疗方法的价值[11]。

1.1.5 抗纤维化 DMD 患者体内转化生长因子（TGF）-β通常过表达，且TGF-β 水平与患者的肌肉组织纤维化程度相关，因此抑制TGF-β 可以减少肌肉纤维化，减轻DMD 症状。常山酮是TGF-β 信号通路下游Smad3磷酸化的抑制剂，能增强肌肉中卫星细胞的活性及肌细胞的存活，减轻患者肌肉组织的纤维化和炎症，目前HT-100（缓释常山酮）正在进行临床试验[12]。小分子酪氨酸激酶抑制剂Nintedanib 能降低成纤维细胞增殖和转移能力，减少纤维化基因如COL1A1、COL3A1、FN1、TGFB1和PDGFA 的表达。研究中Nintedanib 减弱了mdx 小鼠骨骼肌的纤维化并诱导功能性肌肉改善，显示出其成为DMD 药物的潜能[13]。

1.1.6 针对无义突变的通读疗法 约15%的DMD 患者是由于点突变导致了终止密码提前出现使mRNA翻译提前终止，不能产生完整的蛋白。PTC 制药公司研发生产的Ataluren（Translarna）可以与核糖体结合，使其翻译含提前终止密码子mRNA，从而能表达完整蛋白质。该药已在2014年获得欧洲医药管理局条件性批准用于5岁以上有行走能力的无义突变DMD 患儿，近年来进一步被批准用于2～5岁无义突变DMD患儿[14]。关于其使用范围的临床研究正在进行。

1.2 物理治疗

适量的运动训练以及应用矫形支具可以刺激DMD 患者肌肉蛋白质的合成，延缓呼吸衰竭，防止关节挛缩。近年来有研发虚拟现实（VR）游戏训练方案以增加训练的趣味性，也有研发供DMD 患者使用的机器人上肢外骨骼，是使DMD 患者能够继续使用手臂功能的可移动设备。

1.3 基因治疗

1.3.1 基因替代疗法 基因替代疗法是指在DMD 患者基因组中插入外源的DMD 基因，表达出有功能的Dystrophin 蛋白，以缓解患者症状的方法。由于DMD基因大，受腺相关病毒（常用的基因载体）装载容量的限制，一般采用截短的微型DMD 基因microdystrophin。研究者对DMD 实验狗进行microdystrophin 基因治疗后，实验狗肌肉退化速度降低，且没有发现严重的副作用[15]。美国现已开展微型DMD 基因治疗的一期和二期a 的临床实验。因microdystrophin 不能发挥全长Dystrophin 的功能，研究者也在研究如何扩大基因载体的容量。双腺相关病毒基因载体技术[16]和慢病毒载体可能用来装载全长的DMD 基因[17]。

1.3.2 外显子跳跃法 针对移码突变导致的DMD 疾病，利用反义核苷酸与pre-RNA 杂交，诱导切除特定的外显子，能使移码突变的mRNA 阅读框恢复，可编码产生截短的Dystrophin 蛋白，恢复其部分功能。FDA在2016年批准的eteplirsen 是一种能够跳跃51号外显子的反义核苷酸，适用于大约13%的DMD 患者治疗。使用etepliesen 长期治疗能促进有功能的Dystrophin 蛋白表达[18]，延缓患者呼吸功能的下降[19]，但eteplirsen 疗效需进一步确认和改善。目前已开发出新一代跳跃51号外显子治疗药物，新加入的细胞渗透肽能够提高药物渗透入细胞的能力，从而提高治疗效果[20]，另一新开发出的51号外显子跳跃药物WVE-210201早期研究数据显示效果强于eteplirsen[21]，两者都处于一期临床实验阶段。53号和45号外显子跳跃药物golodirsen 和casimersen 也在进行临床实验。实验发现治疗后患者抗肌萎缩蛋白有明显增加[22]。

1.3.3 基因编辑 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑既可通过引入小的插入或缺失使移码突变的DMD 基因恢复编码框（reframing），又能诱导外显子跳跃，还能通过基因重组纠正无义突变等。利用基因编辑的方法，去除mdx 实验鼠突变的21～23外显子，恢复DMD基因编码框，实验鼠Dystrophin 蛋白的表达增加，心肌的功能有所恢复[23-24]。对缺失DMD 基因50外显子的实验鼠进行基因编辑实现reframing 或跳跃51号外显子，同样显示了良好的治疗效果[25]。目前递送基因编辑组件一般采用病毒载体，存在有效率低及安全性差等问题。研究者设计了一种新的递送方法CRISPR-Gold，用金纳米粒子装载基因编辑组件进入细胞。实验中对mdx 小鼠肌肉细胞注射，与对照组相比抗肌萎缩蛋白修复增多，肌肉力量增强[26]。

1.4 干细胞疗法

干细胞是一种具有自我复制能力并且可以分化成多种功能细胞的多潜能细胞。干细胞疗法是将自体或同种异体干细胞移植到DMD 患者体内，使其分化成肌细胞并表达肌萎缩蛋白，从而治疗患者。

心肌损害是患者死亡的其中一个非常重要的原因，因此正在研究一种心肌干细胞疗法CAP-1002，获取健康供体的心脏组织进行培养后注入患者的冠状动脉至心脏，目前正在进行的一期、二期临床实验显示了该方法的安全性，并且患者的心脏和手臂功能得到明显改善[27]。除此之外，诱导多能干细胞（iPS）、骨髓基质干细胞（MSCs）、肌源性干细胞（MDSCs）都有其对DMD 进行干细胞移植治疗的潜力。但多数干细胞移植还存在同种异体免疫反应、低存活率、移植量限制及形成肿瘤的潜在风险等问题。研究者开发了嵌合细胞疗法，将正常供体的细胞和患者细胞融合后制备嵌合细胞，再移植进mdx 小鼠中，结果显示小鼠肌肉力量和功能显著改善，且因为带有自体细胞，相对副作用少[28]。

干细胞疗法还可以与基因治疗相结合，对来自DMD 患者的干细胞进行基因修复，基因修复后的干细胞在实验室中培养分化为肌肉细胞，再将这些肌肉细胞注射进mdx 小鼠体内，结果小鼠产生了健康的肌肉纤维和肌肉卫星细胞，肌肉功能也有明显的改善。使用改造后的干细胞治疗mdx 小鼠，小鼠更短时间内就生长出健康的肌肉纤维[29]。

2 展望

针对DMD，有很多治疗方法目前正在研究中。其中基因治疗DMD 的研究在近年来取得了较大进展，包括治疗手段的多样化及递送载体的不断改进，但基因治疗中很多潜在隐患也需要进一步解决。随着基因编辑技术的发展，干细胞和基因治疗相结合的疗法展现出了良好的前景。对症治疗的方法，由于其不像基因治疗对患者突变类型有要求，可造福所有患者，容易快速地进入临床实验，也是不可忽视的研究方向。物理治疗方法相对来说只能延缓患者病情，但其能够延长患者寿命，提高患者生存质量，值得推广和发展。目前，众多的治疗方法对动物模型包括mdx 小鼠及GRMD 金毛狗都已经展现出较好的治疗效果，但是在人类身上还需要进一步临床实验验证，以确保药物的有效性和安全性，避免出现严重的副作用。相信目前仍无药可治的DMD 在不久的将来会在研究者们共同的努力下最终被攻破。