高迁移率族蛋白1与类风湿性关节炎的相关性研究进展

刘 伟 黄 健 陈彩霞 王 丹

1.内蒙古医科大学大学第二附属医院关节外科，内蒙古呼和浩特 010010；2.内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心，内蒙古呼和浩特 010010；3.内蒙古医科大学附属医院老年医学中心，内蒙古呼和浩特 010010

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节病变为主要表现并以关节滑膜炎症及关节病变进行性发展为主要特征的慢性免疫系统疾病。高迁移率族蛋白1（high mobility group box chromosomal protein 1，HMGB1）是一种高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白，在相关因子刺激下可释放至细胞核外及细胞外参与炎性反应并表达一定生物学特性，其在RA等多种炎症性自身免疫性疾病中均发挥重要的作用[1]。目前，HMGB1已成为RA 发病机制研究的新热点，本文就RA 及HMGB1的基本特征及两者的相互作用机制进行浅析。

1 类风湿性关节炎（RA）

RA 是一种以全身性多关节受累、关节滑膜炎症进行性发展以及骨和软骨组织不可逆性破坏为主要特征的慢性非特异性炎性疾病[2]，病变呈全身性及对称性。RA 在年龄30～60岁的女性中发病较为常见[3]。近年来其发病率逐渐升高，世界范围内成人的发病率为0.5%～1%[4]。RA 作为系统性疾病其发病与自身免疫、遗传及外界环境等多种因素有关[5-8]，但迄今尚无定论，其基本病理改变为关节滑膜的慢性炎症[9-10]。

2 类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞/类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞（RASFs）

正常关节滑膜由1～2层滑膜细胞构成，即滑膜成纤维细胞（成纤维细胞样滑膜细胞）和滑膜巨噬细胞（巨噬细胞样滑膜细胞）[11]。

以往研究考虑滑膜成纤维细胞是一种未涉及关节病变的生理性细胞，分泌关节滑液营养关节软骨并在关节活动过程中起润滑作用，分泌及微量炎性细胞因子主要起维持滑膜内环境稳态的作用[11]。近来，相关研究报道并证实在RA 病损关节滑膜组织的病理研究中，滑膜及滑膜细胞并非呈生理性表现，体现为关节滑膜明显增厚，RASFs 大量增生[12]。另有相关研究表明RASFs 参与合成并释放参与炎性反应的炎性细胞因子以及参与骨与软骨基质降解的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）作用于关节腔，从而引起关节软骨和骨组织的破坏[12-13]。故而RASFs 的大量形成是类风湿性关节炎发生、发展和转移的关键[14-18]。然而，该病理过程的确切发生机制尚未可知，有待进一步实验论证。

3 高迁移率族蛋白1（HMGB1）

HMGB1最初由Johns 于20世纪60年代初期发现，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中（Western blot 中的SDS-PAGE）迁移率高而得名，是一种在大多数真核细胞中广泛表达、且高度保守的非组蛋白核蛋白[19]。HMGB1一级蛋白质结构包括215个氨基酸残基，其超二级结构包括A box 和B box 两个结构域，每一个结构域由与另一结构域29%同源且65%相似的80个氨基酸残基构成，可提供相应功能DNA 次级结构结合位点[19]。HMGB1 B box 为促炎因子作用结构域，重组的B box 可激活单核巨噬细胞并促使其释放肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、γ 干扰素（interferon-γ，INF-γ）、白细胞介素1β（interleukin1β，IL-1β）、细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）及血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）等多种炎症介质[20]。A box是一个抗炎因子结构域，竞争性抑制B box 及全长HMGB1的活性[21-22]。脉冲追踪研究揭示，HMGB1存在于细胞内及细胞外[1]。存在于细胞内细胞核中的HMGB1其DNA 次级结构结合域可与DNA 相关位点结合，调节DNA 的双螺旋结构构象，进而参与DNA的复制、转录、修复、核小体的稳定及细胞运动等[23]。存在于细胞外的HMGB1本身不具备炎症活性[24-25]，但其可与内、外源性促炎因子结合形成复合物，以协同刺激的方式在炎性反应中起重要作用[26-27]。研究表明，外源性促炎因子包括酯多糖（lipopolysaccharide，LPS）、细菌DNA、细菌RNA等，其中LPS 具有代表性。内源性促炎因子包括细胞因子IL-1β、趋化因子CXCL12及核小体等，其中IL-1β 具有代表性[26,28-29]。

HMGB1-partner 分子（内、外源性促炎因子）复合物可与Toll 样受体2（toll-like receptor，TLR2）、Toll样受体4（toll-like receptor4，TLR4）、晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）及趋化因子CXC 受体4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）等多种细胞表面受体结合，刺激单核巨噬细胞激活NF-κB 通路引起炎症效应[30]。研究证实有50%～60%的HMGB1信号转导效应与RAGE 的相互作用有关，但目前RAGE 具体机制尚未阐明，有待后续研究论证[31]。而HMGB1所引起的炎症效应中合成并释放的TNF、INF-γ 及IL-1β等细胞因子又可反作用于单核巨噬细胞使其释放HMGB1[32]，促进炎症效应。

动物实验证明，HMGB1基因敲除的细胞发生坏死时其炎性反应明显减弱[33]。另有研究表明，人及鼠单核巨噬细胞中加入纯化的重组HMGB1，产生炎症效应共同培养时间较内毒素刺激明显推后[1]。

基于在不同模式的炎症环境中以HMGB1为靶点的炎症效应表达，可以推断胞外的HMGB1是一种潜在的中晚期炎症诱导因素[27,34-35]。

4 HMGB1与RA 相关性

4.1 RA 患者血清中HMGB1表达

目前，对于RA 患者血清中HMGB1的表达，国内外研究尚存争议。相关研究对纳入67例活动期RA患者及21名健康对照人员进行检测，活动期RA 患者血清HMGB1表达明显高于健康对照人员，差异具有显著性[36]。另一项研究纳入105例样本，结果显示RA 患者血清HMGB1表达高于活动期组，活动期组RA患者血清HMGB1表达高于缓解期组，三组组间比较差异有统计学意义[37]，这一结果与国内多数研究报道一致[38-44]。但早期报道对纳入30例RA 患者的样本进行研究，其血清HMGB1水平与正常对照组比较差异无统计学意义，其可能与样本含量及检测手段有关[45]。

部分研究考虑血清HMGB1来源于细胞核内，由溶血磷脂酰胆碱诱导溶酶体胞吐作用的非典型囊泡运输途径出胞[46]。另有研究认为其可能来源于外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）[47]或滑膜巨噬细胞的主动分泌及炎症效应中的坏死细胞[48]。然而其确切来源尚不明确，有待深入研究。

炎症诱导因素HMGB1的血清表达可能与RA 全身性滑膜炎症的病理过程具有相关性。

4.2 RA 患者血清中HMGB1表达与血液炎性因素相关受体表达的相关性

RA 患者血清HMGB1表达与血液炎性因素相关受体表达相关。活动期RA 患者血清HMGB1表达与PBMC 表面TLR2及TLR4表达呈显著正相关，其表达量均显著高于非活动期RA 患者及健康对照组[41,44,47]。另有研究证实RA 患者血清HMGB1与RA 保护性因子基质金属蛋白酶-2（matrix metalloprotein-2，MMP2）及其组织抑制因子-2（tissue inhibitor of metallopro teinase-2，TIMP2）水平呈负相关[40]。

故而血清HMGB1表达与血清炎症因素表达可能在加重RA 关节滑膜慢性炎症的病理过程中起重要作用。

4.3 RA 患者血清中HMGB1表达与临床指标的相关性

RA 患者血清HMGB1表达与反映RA 炎症程度和病情活动指标的相关性尚未明确。研究报道RA 患者血清中HMGB1表达水平与红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）[41-42]及类风湿因子（rheumatoid factor，RF）呈正相关[43]，与关节压痛数、肿胀数、关节X 线分期呈正相关[37,47]。但也有研究显示，活动性RA 患者血浆HMGB1水平与疾病病程、RF、抗环瓜氨酸肽抗体、关节压痛数、关节肿胀数及关节X 线分期无关[42]。尚有研究考虑活动性RA 患者血清HMGB1表达水平与疼痛视觉模拟评分法（VAS）评分、疲乏VAS 评分、肿胀关节数、压痛关节数及ESR、CRP、抗环瓜氨酸肽抗体无相关性[36]。样本量不足可能是上述研究差异性来源，有待多中心研究确定其相关性。

血清HMGB1在类风湿性关节炎相关病变早期是否具有临床诊断参考作用还有待进一步研究证实[43]。

4.4 RA 患者滑膜中HMGB1表达

动物实验显示正常健康小鼠HMGB1表达于滑膜细胞的细胞核内，HMGB1的细胞质及细胞外基质的沉积极少存在，而佐剂诱导RA 小鼠模型于RASFs细胞质及细胞外均有HMGB1的过量表达[21-22]。相关研究显示正常健康人关节滑膜上皮细胞存在HMGB1的表达，其分布以细胞核为主，于细胞质及细胞外基质中微量表达，为典型非组蛋白核蛋白表现。而RA 关节滑膜中HMGB1分布以滑膜巨嗜细胞为主，RASFs和血管内皮细胞也有一定量表达，滑膜下炎症细胞极少有HMGB1的表达，且RA 关节滑膜细胞的HMGB1表达于细胞外基质及细胞质，细胞核内少量存在及表达[49]。

作为炎性反应中重要因子的HMGB1，其滑膜表达异常在RA 组织炎症和损伤的病理过程中起重要作用[45]。

4.5 RA 患者滑膜中HMGB1表达与滑膜炎性因子表达的相关性

研究显示在RA 患者关节病变早期，尚未增生的滑膜组织包括滑膜细胞外基质及细胞质已有HMGB1的分布异常及表达异常，但在此阶段滑膜组织中未发现相关炎性因子的增加[49]。随滑膜组织进一步增生，细胞外基质及细胞质中HMGB1表达持续增加，滑膜TNF、IL-1β、INF-γ 和IL-6等炎症介质表达量明显上升，且相关数据表明HMGB1表达量与滑膜TNF、IL-1β、INF-γ 和IL-6等炎性因子表达量呈协同相关性[38,49]。HMGB1及相关炎性因子在增生的滑膜组织的表达可能是参与RA 关节滑膜慢性炎症的重要原因之一。

研究证实，缺血、激活的补体或TNF、IL-1β等炎性细胞因子刺激均可致关节滑膜HMGB1大量表达[50]。而相关研究表明HMGB1可刺激滑膜细胞释放TNF、IL-1β、INF-γ 和IL-6等炎性因子，并呈剂量依赖性。故可推测HMGB1与相关炎性因子具有相互促进释放的作用，而这一作用又加重RA 关节滑膜慢性炎症的迁延过程。

4.6 HMGB1与RASFs 体外培养后分泌炎性细胞因子及MMPs 的相关性

研究表明，体外HMGB1促进RASFS 分泌炎性细胞因子及MMPs。HMGB1与IL-1β 或LPS 协同刺激可显著促进RASFS 分泌TNF、IL-1β、INF-γ、IL-6、IL-8及MMP-3、MMP-13[45,51-52]。酶联免疫吸附测定（ELISA）双抗夹心法观察相关致炎细胞因子及MMP 的表达水平，RT-PCR 显示HMGB1与LPS 检测其mRNA 表达水平，结果均证实HMGB1刺激与RASFs 释放炎性细胞因子、MMP 具有相关性[12]。

炎性细胞因子及MMPs 在RA 滑膜慢性炎症中具有关键作用，其不仅可由免疫分泌，还可以由RASFs分泌[12,40]。正常状态下只有少量滑膜成纤维细胞/成纤维细胞样滑膜细胞合成部分细胞因子，其可能对维持关节内的免疫调节和防御功能有一定积极作用[12]。而HMGB1刺激状态下的炎性细胞因子及MMPs 显著增多很可能是参与了RA 的病变过程[12,51]。

4.7 HMGB1与RASFs 体外培养后增殖凋亡及自噬的相关性

体外HMGB1促进RASFs 增殖及自噬并抑制其凋亡。流式细胞术（flow cytometry，FCM）结果表明与空白对照组、HMGB1刺激组、LPS 刺激组比较，HMGB1-LPS 复合物刺激后RASFs 进入S/G2期明显增多，CCK-8显示细胞增殖加快[3,11-12,51-52]。免疫印迹（Western blotting，WB）检测各种刺激物刺激RASFs细胞Beelinl 和LC3 Ⅱ的表达变化，透射电镜观察自噬小体及自噬溶酶体，并经免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3和Atg5表达，结果显示，与HMGB1-LPS 复合物刺激后比较RASFs 自噬明显增强[3,11]。Annexin VFITC/PI 双染后FCM 检测磷脂酰丝氨酸外翻及WB法检测Bax/Bcl-2相关蛋白表达，结果表明HMGB1-LPS复合物定量刺激之后，RASFs 凋亡明显减弱[3,11-12]。

HMGB1刺激下RASFs 增殖、凋亡及自噬平衡异常与RA 起病密切相关，RASFs 在增殖水平增强的情况下，凋亡水平明显降低，自噬水平显著升高，进而RA 患者病变关节滑膜组织进行性、病理性增生，最终影响病人的正常关节功能和结构[53-55]。最终RASFs 增殖、凋亡及自噬失衡促进了RASFs 的病变过程[56-61]。

最近研究发现抑制RASFs 自噬，则细胞凋亡增多，结果提示自噬与凋亡可能存在一定的相互拮抗作用。这一结论可为抑制RASFs 自噬促使其凋亡，进而控制或减缓RASFs 病理性增生提供理论依据，有待进一步相关研究。

4.8 HMGB1与RASFs 体外培养后细胞表型转变的相关性

HMGB1-LPS 复合物刺激后，体外研究培养的骨性关节炎滑膜成纤维细胞（osteoarthritis synovial fibroblasts，OASFs）出现向RASFs 转变的特征。与阴性对照组OASFs 细胞相比，HMGB1刺激后OASFs 细胞表型接近于RASFs：进入S/G2期明显增多，细胞增殖加快；Bcl-2表达上调、Bax 表达降低，细胞凋亡受到抑制；LC3Ⅱ表达增多，细胞自噬增加；相关受体TLR2、TLR4及RAGE 表达上调[11,37]，同时趋化因子CCL2、CXCL12及黏附分子ICAM、VCAM 表达上调；细胞炎症相关性信号通路分子NF-κB、SAPK/JNK 和p38 MAPK 明显激活[12,52]；促炎细胞因子（TNF、IL-1β、INF-γ 和IL-6等）及MMPs mRNA 水平和蛋白表达水平上调[11]。

HMGB1-LPS 复合物可能与SFs 上的TLR2、TLR4、RAGE 结合，激活下游NF-κB、SAPK／JNK 和p38 MAPK信号通路，导致促炎细胞因子、趋化因子CCL2、CXCL12、ICAM、VCAM 的分泌，产生MMPs等，进而使得SFs增殖加速、自噬凋亡失衡，这一病理过程促使OASFs向RASFs 转化，表型转变的RASFs 呈现RA 的临床表现与病理过程。故可知HMGB1-LPS 复合物有重要的促RASFs 作用，这一作用与RA 疾病演变紧密相关。

5 讨论

RA 是自身免疫系统的慢性炎症性疾病，其最主要的特征是慢性滑膜炎症引起关节软骨和骨组织病变，影响关节结构及功能。RA 患者滑膜组织的主要特征是RASFs 过度增生并异常表达炎性细胞因子。

HMGB1作为炎症诱导的中晚期，炎症介质在RA血清及滑膜组织中均过度异常表达，说明其参与了疾病过程，在关节滑膜、关节软骨与骨组织病变中起着重要作用，且其表达水平与RA 病理过程及病情严重程度密切相关。

HMGB1参与刺激PBMC 表面TLR2及TLR4表达上调，及滑膜TNF、IL-1β、INF-γ 和IL-6等炎性因子释放。大量研究表明，细胞外和胞内的TLR 配体活化激活惰性分化因子88（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）依赖的MAPKs 通路，进而活化NF-κB，最终导致炎性细胞介质产生并释放，外周血TLR 下游信号通路的激活与RA 关节病变过程密切相关。

HMGB1识别并上调体外培养SFs 上的TLRs 及RAGE 受体，进而激活下游NF-κB、p38 MAPK等炎症相关性信号通路，导致促炎细胞因子（TNF、IL-1β、INF-γ 和IL-6等）、趋化因子（CCL2、CXCLl2）、黏附分子（ICAM、VCAM）及MMPs 的异常表达；激活下游自噬相关信号通路Akt-mTOR，促进Ptdins3KC3与Beclinl 结合，直接导致细胞的自噬增强、凋亡减少和增生活跃，进一步放大其病理效应。HMGB1可体外诱导OASFs 转化的RASFs 样细胞，变形转变后其具有明显的致病性，可大量分泌MMPs 对软骨造成损伤，其生物学效应与RASFs 细胞类似。

综上所述，RA 是骨关节科以及风湿免疫科临床工作中常见的自身免疫性疾病。病程中后期，关节病变所致的疼痛与关节畸形严重影响患者的生活质量。对与病情稳定的非活动期RA 患者，除关节置换外目前尚无有效治疗方案。HMGB1是一种潜在的炎症诱导因素，其与RA 的发生、发展有关，是RA 发生、发展这一生物学行为的关键调控分子，故而HMGBl 以及RASFs 在RA 中的作用有重要意义。但相关机制仍不完全清楚，随着研究的深入，HMGB1将进一步解读RA 致病机制，为临床治疗RA 带来希望。