冷冻消融联合免疫治疗实体肿瘤研究进展

孟亮亮，张 肖，张啸波，吴 斌，李 竞，何晓锋，魏颖恬，张 欣，肖越勇*

(1.中国人民解放军总医院放射诊断科，北京 100853；2.武警北京市总队医院医学影像科，北京 100027)

治疗实体肿瘤的首选方法是外科手术切除，但较大比例患者确诊时已无手术指征，且手术对人体免疫防御系统损伤显著。CT或MRI引导下冷冻消融具有创伤性小、并发症少、导向精准、疗效显著、恢复迅速等优点，已广泛用于临床治疗肿瘤[1]。冷冻消融不仅能使肿瘤组织坏死和凋亡，还可促进肿瘤来源自身抗原释放至血液循环中，刺激宿主免疫系统产生针对原发性和转移性肿瘤的良好抗肿瘤免疫效应，导致原发肿瘤及远处转移灶消退，这种附加效应被称为“伴随效应”，被认为是与免疫治疗产生协同抗肿瘤作用的基础[2]。肿瘤免疫治疗利用抗原、抗体、疫苗、细胞或病毒等使机体产生或增强机体抗肿瘤免疫反应，从而达到控制甚至消灭肿瘤的目的。本文围绕冷冻消融所致免疫效应和肿瘤免疫联合治疗肿瘤的效果与机制研究进展进行综述。

1 冷冻消融所致免疫功能改变

冷冻消融灭活肿瘤主要通过以下途径，即细胞外结冰导致溶液效应、细胞内结冰、微血管内血栓形成及介导细胞凋亡[5]。靠近冷冻探针的组织冷冻速率高，温度低至足以引起细胞内形成冰晶，导致细胞器破坏、细胞膜破裂，使细胞即刻死亡；远离冷冻探针的肿瘤细胞所受冷冻损伤程度不及邻近探针者，但当冷冻程度达到细胞不可逆损伤时则发生凋亡；距离冷冻探针更远的细胞仅产生可逆性冻伤。对组织的即刻解冻会使液体进入受损的细胞膜，导致其破裂，再结晶过程产生的剪切力亦会进一步损伤组织[5]。冷冻消融引起的机体免疫功能改变既有刺激性变化，也有抑制性变化。

1.1 冷冻消融引起的免疫刺激 与传统放射治疗相比，冷冻消融的不良反应较少，并能促进更全面、更有效地自体抗原释放到循环中[6-7]。冷冻消融导致的坏死肿瘤细胞通过自身吸收后形成大量肿瘤特异性自身抗原，释放到血液循环，由主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(major histocompatibility complex class Ⅰ, MHC-Ⅰ)处理并递呈，激活细胞毒性CD8+T淋巴细胞，产生抗肿瘤免疫作用，进而使消融后远处转移和术区残留病灶消失[2，8]。Sabel等[9]利用肿瘤再挑战模型对小鼠MT-901乳腺癌细胞进行冷冻消融，发现单纯手术切除肿瘤的小鼠术后肿瘤复发率高达86%，而冷冻术后小鼠肿瘤复发率仅为16%；冷冻消融导致血清白细胞介素12(interleukin-12， IL-12)及γ干扰素(interferon γ， IFN-γ)水平显著升高，自然杀伤细胞活性显著增加。临床冷冻治疗中也发现存在类似抗肿瘤免疫反应。Kato等[10]收集22例肾癌患者冷冻消融前及消融后3个月的肿瘤组织和部分患者血液样本，发现冷冻消融后组织中CD8+、CD4+、颗粒酶A(GZMA)、CD11c转录水平均显著升高，CD8/FOXP3升高，且T细胞受体β(T cell receptor beta, TCR-β)全谱分析显示冷冻消融引起肿瘤组织中某些T细胞扩增，提示冷冻消融可诱导肿瘤免疫反应增强。

1.2 冷冻消融引发免疫抑制 动物实验发现冷冻消融不仅引起抗肿瘤免疫反应，还会引发免疫抑制。Wing等[11]对单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus 2， HSV-2)诱导的仓鼠原发性纤维肉瘤进行冷冻消融，发现冷冻消融能够抑制具有免疫活性的T淋巴细胞增殖的抑制性细胞群的产生，后者导致预后较差。Shibata等[12]认为大鼠纤维肉瘤冷冻消融的早期阶段会增加肺部转移概率，且冷冻后不同时间段大鼠脾脏的抗肿瘤活性均低于手术切除。Blackwood等[13]对大鼠肿瘤模型进行冷冻消融治疗，发现若冷冻后死亡的肿瘤组织大部分留在动物体内时，免疫反应会被抑制；如仅留下少量冷冻组织，则继发性肿瘤的生长受抑制甚至消退，提示抗原刺激存在阈值，过量的抗原可能对免疫反应不利。目前关于免疫抑制的机制尚不明确，但有研究[14]表明可能与坏死与凋亡的比例及调节性T细胞(regulatory T cells， Treg)产生过多有关。肿瘤坏死引起细胞崩解、细胞内容物释放，导致肿瘤周围炎性反应，进而刺激肿瘤特异性T淋巴细胞产生；巨噬细胞或树突状细胞吞噬凋亡细胞后，诱导Treg数量增加，抑制型细胞因子合成与分泌增多，刺激型细胞因子分泌减少，反之则导致抑制性免疫反应[15]。

2 肿瘤免疫治疗

肿瘤免疫治疗的目的是利用自体免疫系统来对抗肿瘤，可分为主动免疫和被动免疫。主动免疫主要作用于免疫系统本身，包括增强机体免疫功能的细胞因子、抗原依赖性的治疗性疫苗和非抗原依赖性的用于调节T细胞功能的抑制剂；被动免疫则作用于肿瘤本身，包括抗肿瘤单克隆抗体和过继免疫疗法(体内激活的T细胞和自然杀伤细胞)。目前临床常见主要免疫治疗策略包括肿瘤疫苗、过继细胞免疫治疗、溶瘤病毒、抗体或重组蛋白等。肿瘤疫苗可通过特异性激活宿主T细胞以对抗肿瘤抗原，但由于抗原选择困难和对肿瘤免疫机制理解欠缺导致其疗效并不理想。溶瘤病毒免疫疗法是利用自然或合成的病毒选择性复制和杀死癌细胞，其作用机制包括肿瘤感染引起的急性肿瘤减瘤、肿瘤细胞裂解及全身性抗肿瘤免疫反应的诱导和启动。溶瘤病毒T-VEC是目前临床应用于晚期黑色素瘤的免疫药物，它是一种经改良的Ⅰ型单纯疱疹病毒，在杀灭肿瘤细胞的同时不会损伤神经元[16]。过继细胞疗法首先从患者的肿瘤组织、引流淋巴结或外周血中分离出淋巴细胞，经体外扩增后的淋巴细胞被重新注入患者体内，利用其抗肿瘤特性来消灭全身的肿瘤细胞[17]。

免疫检查点阻断治疗目前被认为是最有希望和潜力的免疫治疗方法。免疫检查点指免疫细胞膜表面上传导抑制表达信号的分子，正常情况下能保护身体免受剧烈的自身免疫反应，但在肿瘤微环境中可使肿瘤细胞成功逃脱免疫系统的攻击。目前研究最多的免疫检查点分子主要为细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4， CTLA-4)和程序性死亡受体-1(programmed death-1， PD-1)，通过阻断相应的免疫检查点信号通路，可恢复T细胞的活化和增殖能力、增强机体的抗肿瘤免疫应答[3]。一项纳入4项临床试验、2 174例肿瘤患者的Meta分析[18]指出，当肿瘤细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1)阳性表达率>1%时，经抗PD-1/PD-L1抗体治疗的进展期非小细胞肺癌患者的无进展生存期(progression free survival， PFS)和总生存期(overall survival， OS)均明显高于接受化疗者，且安全性更好。Teng等[19]根据肿瘤微环境中PD-L1表达水平和肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrates lymphocytes， TIL)的存在与否将肿瘤分为4种不同类型：Ⅰ型，PD-L1(+)、TIL(+)，即适应性免疫抵抗型；Ⅱ型，PD-L1(-)、TIL(-)，即免疫忽视型；Ⅲ型，PD-L1(+)、TIL(-)，即内在诱导型；Ⅳ型，PD-L1(-)、TIL(+)，即免疫耐受型。不同类型肿瘤对PD-1/PD-L1抑制剂的应答程度不尽相同，其中Ⅰ型的应答率及效果最佳。联合使用PD-1和CTLA-4抑制剂可明显提高免疫治疗效果。Wang等[20]报道，联合抗CTLA-4和抗PD-1抗体可明显抑制胃癌MKN-45和MGC-803细胞增殖、诱导细胞凋亡，并抑制肿瘤细胞迁移、侵袭和上皮间质转化，体现出良好的抗肿瘤效果。

3 免疫治疗与冷冻消融的协同抗肿瘤作用

冷冻消融刺激机体产生抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长，结合特异性免疫治疗可促进和增强这种免疫效应。Zhu等[8]采用PD-1抑制剂联合冷冻消融治疗小鼠肾细胞癌，发现联合治疗对肿瘤转移性生长的抑制作用明显强于单独给药或单纯冷冻，且PD-1抑制剂对冷冻引起的免疫反应具有明显增强作用(包括CD8+TIL数目增加、INF-γ和GZMB mRNA表达水平增加)。Li等[21]观察冷冻消融联合IL-12治疗大鼠异种胶质母细胞瘤对抗肿瘤免疫的影响，发现冷冻联合IL-12治疗的细胞免疫功能显著增强，肿瘤消退，且后续超免疫活性明显增强，其中CD11c+树突状细胞和CD86+淋巴细胞数量明显增加，IFN-γ表达也明显增加。此外，Benzon等[22]探讨肿瘤冷冻消融和免疫检查点阻断抗体之间的潜在协同抗肿瘤作用，发现冷冻消融联合抗CTLA-4抗体治疗使前列腺癌移植瘤小鼠肿瘤生长延迟了14.8天，且死亡率较单纯冷冻消融降低4倍，提示抗CTLA-4抗体可显著增强冷冻消融介导的免疫反应。Waitz等[23]针对小鼠前列腺癌模型进行研究，结果显示联合应用CTLA-4抗体与冷冻消融可有效抑制或减缓继发性肿瘤生长或引发肿瘤排斥反应。但是，冷冻消融联合免疫治疗的效果及安全性的临床证据还不充分，目前仅有少数研究得到与动物实验相似的结果，如Niu等[24]回顾性评估冷冻消融联合免疫治疗对转移性胰腺癌患者的疗效，经过4年随访发现患者中位生存时间明显长于接受单纯冷冻治疗或化学治疗者；Liu等[25]观察冷冻消融联合索拉非尼治疗晚期肾细胞癌的疗效和安全性，发现接受联合治疗的患者对药物的反应率、疾病控制率均明显高于接受索拉非尼单药治疗者，PFS及OS均明显长于索拉非尼单药治疗，且联合治疗者免疫相关指标均明显改善，而未增加不良反应。目前PD-1/PD-L1抑制剂是治疗肿瘤组织PD-L1表达>50%、且未发现分子致癌靶点的非小细胞肺癌的一线方法，但在大多数临床试验[26]中应答率仅约20%，原因可能与肿瘤微环境中较少TIL浸润有关[27]。

冷冻消融与免疫治疗协同抗肿瘤作用的机制目前尚不明确。冷冻消融导致肿瘤抗原大量释放至宿主免疫系统，CD11c+树突状细胞和CD86+淋巴细胞数量明显增加，IFN-γ水平增高标志着TH1型免疫反应增强[28]。冷冻消融可能产生大量自体抗原，于消融术后数日甚至数周内被释放到血液循环中。从肿瘤细胞的异质性群体中提取的多种肿瘤特异性抗原的原位多价自接种疫苗将提供给宿主已启动的免疫系统，有利于全身定位、识别、靶向和破坏肿瘤细胞。当宿主的免疫系统被PD-L1或CTLA-4抑制剂“启动”时，促发Treg细胞、细胞毒性CD8+T细胞免疫反应，从而增强宿主对肿瘤的免疫力，不仅使原发肿瘤消退，还可引起转移性癌灶消退。如通过给予PD-1和/或CTLA-4抗体或抑制剂阻断肿瘤免疫逃逸机制，体内自体抗原被免疫系统处理，在冷冻消融产生自体抗原之前启动自身免疫系统，使肿瘤抗原和宿主的免疫系统绕过癌细胞的防御机制，达到成功治疗肿瘤的目的[29]。

总之，冷冻消融联合全身免疫治疗可提高局部实体肿瘤治疗效果。冷冻速率、血液抗原监测客观量化指标以及联合全身免疫治疗的相关模式、给药时机和治疗监控等未来将会进一步完善。