钙网织蛋白在肿瘤发生发展中的作用研究进展

唐香玲 魏浩然 周建文 唐自沁 张 铮 易 岚

南华大学衡阳医学院生物科学与生物技术系，湖南衡阳 421000

钙网织蛋白（calreticulin，CRT）是一种内质网Ca2+结合伴侣蛋白，在细胞的生理及病理过程中发挥着许多功能。近年来相当多的证据表明CRT 与肿瘤的发生发展密切相关，我们将从肿瘤细胞中CRT 的表达与易位；CRT 对肿瘤细胞增殖的影响；CRT 参与肿瘤细胞的粘附、侵袭、迁移；CRT 与肿瘤细胞分化；CRT 与肿瘤细胞凋亡；CRT 与肿瘤细胞吞噬；CRT 可以作为一种潜在的癌症诊断分子标记物等方面进行综述。

1 CRT的表达、结构和功能

1974 年，CRT 首次被鉴定为一种存在于肌质网中的Ca2+储存蛋白。然而，一系列的研究表明CRT 在非肌肉组织中含量也很丰富。CRT 的结构在进化中是高度保守的，主要由三个结构域组成：N 结构域、P 结构域和C 结构域，C 结构域含有一个内质网滞留信号的四肽KDEL，N 末端包含信号肽，每个结构域都有相对应的功能。CRT 的生物学功能是严格地由氨基酸序列决定的稳定的空间结构来限定的，CRT 也含有固有的无序区域，其结构上表现出的高度动态构象特征是通过为响应各种环境信号而发生几种亚稳态构象之间的不断变化实现的。在金黄色酿脓葡萄球菌及副溶血性弧菌中，CRT 似乎参与抗细菌免疫反应。在矮牵牛花异常伸长的花粉管中，CRT 基因转录后的表达沉默改变了ER 的定位和使ER 结构紊乱，最后导致细胞质流动受到抑制，大多数花粉管破裂[1]。在中华绒蝥蟹中，CRT 在鳃、肝胰腺、血淋巴细胞及肠中表达，且表达水平受脂多糖类、肽聚糖类影响。哺乳动物的CRT 是一种存在于内质网内外的46 千道尔顿的凝集素样的分子伴侣蛋白。在内质网腔中，CRT 起着调控细胞内Ca2+稳态、氧化应激反应、分子伴侣及凝集素结合反应，参与确保新合成的蛋白质的正确折叠及糖蛋白的形成的作用[2]。CRT 也被发现存在于内质网区域外，包括细胞器及细胞外基质中。细胞表面的CRT 可以调节细胞的粘附力、细胞的相互作用、细胞转移、吞噬、整合素依赖的Ca2+信号及免疫反应，同时在细胞增殖、分化及凋亡中起着重要作用[3]。另外，CRT 也被发现存在于细胞毒性T 淋巴细胞及精子的顶体泡的核被膜、核及核仁样的结构中。CRT 的异常与许多疾病是相关联的，CRT 调控一系列的细胞病理反应过程，例如伤口愈合、纤维症及癌症。近来研究结果表明CRT 在肿瘤的形成及发展过程中起重要作用[4]。突变特异性的免疫组织化学方法已经证实骨髓增殖性肿瘤中的CRT 发生了突变，CRT 是骨髓增生性肿瘤中第二个最频繁的突变，它们都在C 端结构域中产生一种反复的移码，影响CRT 的定位和钙结合功能[5]。在30% 的原发性血小板增多症和骨髓纤维化患者中也存在钙网蛋白CRT 基因发生移码突变[6]。

2 肿瘤细胞中CRT的表达与易位

在哺乳动物中，CRT 的表达水平在各种器官和组织中显著不同，表明CRT 在每种细胞类型中发挥着不同作用。钙网蛋白在哺乳动物中表达普遍较低，但在一些癌症中却表达上调。采用蛋白质组学技术发现CRT 在食管癌和乳腺癌中表达上调[7]。采用免疫组织化学检测79 例胃癌患者中，发现53例高表达CRT。此外，CRT 的表达与肿瘤大小和向远处转移的发展呈正相关。肺癌患者血清CRT 浓度高于健康人，肺癌细胞膜CRT 水平更与肿瘤病理分级有关。用7，8- 二乙酰氧基-4- 甲基香豆素及二烯丙基二硫化物（DADS）等处理癌细胞可以影响CRT 的表达。同时，多种试剂如汉黄芩素和蒽环霉素等也可影响CRT 在肿瘤细胞中的定位。钙网蛋白转位的机制至今尚未完全阐明，CRT 通常不存在于癌细胞的ER 腔中，而是存在于乳腺癌和急性髓性白血病细胞的细胞表面。最近研究提出一种CRT 膜易位的机制，在凋亡应激条件下，CRT 的胞浆浓度上升，并通过钙离子与细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）结合。PS 的分布受氨基磷酸脂转位酶（APLT） 的调节，它将PS 维持于细胞膜的胞浆面。凋亡过程中，在CRT 升高的同时，NO 浓度也显著性上升，而氨基磷酸脂转位酶对氧化还原修饰敏感，其巯基可被活性氮自由基修饰而丧失活性，氨基磷酸脂转位酶的失活将导致PS 重新分布，部分PS 从胞浆面外翻到细胞膜外侧面，从而将与其结合的CRT 带到细胞膜的表面。

3 CRT对肿瘤细胞增殖的影响

CRT 的表达水平深刻地影响肿瘤细胞的增殖。CRT 已被证明具有抗血管生成活性，促进肿瘤淋巴细胞浸润和抑制肿瘤生长的作用。CRT 高表达可上调胎盘生长因子PIGF 与VEGF mRNA 与蛋白的表达，而沉默CRT 对PIGF 与VEGF 的表达没有影响，表明CRT 可通过上调PIGF 与VEGF 促进胃癌细胞增殖[8]。在胰腺癌细胞中，CRT 以MEK/ERK途径依赖性方式调节细胞增殖和其他行为，CRT 与MEK/ERK 通路之间的相互作用可为肿瘤治疗提供新的思路。另外，研究发现过表达CRT 的膀胱癌J82 细胞具有更强的细胞增殖、迁移和粘附能力而CRT 的敲除抑制了J82 膀胱癌细胞的增殖。类似地有，CRT 的过表达抑制NB 细胞系stNB-V1的增殖[9]。TSP 处理与CRT 过表达的组合显著抑制MCF-7 细胞异种移植物的生长。将钙网蛋白靶向连接纤维连接蛋白可导致肿瘤生长迟缓[10]。而siRNA 介导的CRT 表达敲除却显著抑制DADS 处理的HL-60 细胞的增殖。近来研究发现在S100A8和S100A9 粒细胞中，S100A8/9 介导的对增殖相关的Akt 和Erk1/2 信号通路的抑制可通过CRT 突变依赖的tlr4 基因阻断而降低[11]。此外，CRT 易位和突变表达也影响肿瘤细胞增殖。在AML 细胞中，细胞内CRT 易位至细胞表面，表明其在肿瘤抑制中起作用。综上所述，CRT 与肿瘤的增殖密切相关。

4 CRT参与肿瘤细胞的粘附、侵袭、迁移

CRT 过表达与细胞粘附增加有关，这些变化可能是由CRT 介导的来自ER 中的由于钙粘素/ 连环蛋白系统和蛋白酪氨酸激酶/ 磷酸酶活性变化的Wnt 信号通路造成的。血小板反应蛋白（TSP）的抗粘附活性由细胞表面CRT 的N 端结构域介导，TSP通过与细胞表面CRT 的17 ～ 35 个残基（hep Ⅰ肽）结合诱导局灶性粘连的发生，结合到低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP 1）共复合物的TSP 1 的N 端结构域抑制细胞粘附并通过粘着斑拆卸增加细胞运动。CRT 也参与了癌症侵袭和迁移进展。对J82膀胱癌细胞进行CRT 敲除抑制来研究细胞迁移和粘附情况，发现进行CRT-RNAi 的 J82 膀胱癌细胞与对照细胞相比细胞明显变小且细胞在体内肺和肝脏的转移位点明显减少[12]。与CRT 基因敲除细胞相比，在CRT 过表达的人胃癌细胞株AGS 中细胞迁移率提高，提示其可能是本病重要的治疗靶点。CRT 还可通过NRP1（神经纤毛蛋白-1）调控食管癌细胞迁移和侵袭[13]。此外，CRT 过表达促进胃癌细胞血管生成和迁移，这与CRT 和胃癌微血管密度、肿瘤浸润及淋巴结转移的关系是一致的。在食管鳞癌细胞中，研究显示siRNA 介导的CRT 敲除导致细胞迁移、侵袭的能力受损。CRT 还影响癌细胞间的相互作用。CRT 通过调节Slug/E- 钙粘素途径来调节上皮间充质细胞转型，提示CRT 在上皮细胞与其他细胞间相互作用中的一种新功能。在肿瘤内皮细胞中，CRT 过表达导致白细胞- 内皮细胞相互作用及淋巴细胞浸润到肿瘤中的效应增强。综上所述，CRT 影响着肿瘤细胞的粘附、侵袭、迁移能力。

5 CRT与肿瘤细胞分化

CRT 在细胞分化中起着重要作用[14]。CRT 在去分化脂肪肉瘤细胞中高表达，在通过siRNA 介导的CRT 的下调实验研究中发现去分化脂肪肉瘤细胞的成脂和细胞增殖的减少。因此，在分化的脂肪肉瘤中CRT 的异常表达涉及细胞去分化和肿瘤的发生。在细胞分化过程中，CRT 基因导入H9c2 大鼠心肌细胞显著抑制蛋白激酶B/Akt 信号转导，表明CRT 在心脏分化中起重要作用。CRT 缺陷小鼠和转基因小鼠的研究显示CRT 可能是钙依赖通路的上游调节者，控制着细胞分化和器官的发育。其他研究表明CRT 可能是小鼠骨髓源性肥大细胞的分化和功能的重要调节者[15]。此外，有多份报告表明，调控CRT 表达水平对神经瘤细胞分化有深刻的影响。例如，在神经母细胞瘤（NB）研究中，我们发现CRT 是一种新的mycn（NB 的生物标记物）抑制因子，通过下调mycn 启动子活性和蛋白表达来调节神经元分化[16]。同时，CRT 过表达促进stNB-V1 细胞的分化，血管内皮生长因子A 也参与了与CRT 相关的NB 细胞分化[17]。另外研究发现，c-jun-NH（2）激酶-CRT 依赖通路是Notch 信号阻断诱导神经元分化所必需的。在研究生理造血过程中，我们发现CRT 在正常造血分化调节中起着重要作用，CRT 的过度表达可以通过促进红细胞和巨核细胞的分化来影响生理造血。从细胞表面释放出来的血管抑素（CRT 的N端结构域）已经被证明对髓系细胞的分化和骨髓微环境的血管化有影响。因此，CRT 对血管及血细胞的分化有重要的影响。此外，硝基蓝四唑胺（NBT）测定显示在CRT 过表达细胞组中NBT 的减少受到抑制，CRT siRNA 组中NBT 的减少得到增强，明显支持CRT 在DADS 处理的HL-60 细胞的分化中的作用[18]。综上所述，CRT 在肿瘤细胞分化中起着重要作用。

6 CRT与肿瘤细胞凋亡

有许多研究表明CRT 在肿瘤细胞凋亡的调节中起作用。用CRT 转染的人乳腺癌MCF-7 细胞对细胞凋亡的敏感性明显高于对照组细胞，在MCF-7和MDA-MB-231 细胞中CRT 过表达显著促进细胞凋亡，这表明CRT 可以触发肿瘤细胞死亡的新机制。此外，在可以导致体内免疫反应的吞噬细胞增多症中，蒽环类药物治疗、电离辐射或光动力疗法通过激活先天性和适应性免疫反应导致免疫原性的肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞中，CRT 易位到细胞膜产生“eat me”的信号，从而促进抗凋亡细胞的清除反应，导致肿瘤细胞死亡。例如，CRT 与Fas 配体（FasL）结合并抑制Fas/FasL 介导的Jurkat T 细胞凋亡。在缺血性中风的早期阶段，CRT 的增加也抑制了Fas/FasL 介导的神经元细胞凋亡，这表明它在缺血再灌注损伤后不久可能具有保护作用。CRT还可通过诱导应激反应促进肿瘤细胞凋亡。例如，在用蛋白酶体抑制剂硼替佐米（bt）治疗的人胶质瘤细胞株凋亡中发现，在各种应激条件下，R-CRT与应激颗粒（SGS）结合或转位到质膜上，参与促凋亡信号传导[19]。玉米赤霉烯酮（Zearalenone）可通过诱导ER 应激诱导人白血病细胞HL-60 和U937的凋亡。除此之外，CRT 还可通过干预主要组织相容性抗原分子及装配因子的加工折叠，影响抗原递呈细胞，促进吞噬细胞对肿瘤的摄取和吞噬，加速肿瘤细胞的凋亡。由此可见，CRT 与肿瘤细胞的凋亡密切相关。

7 CRT与肿瘤细胞吞噬作用有关

人肿瘤细胞表面高表达的CRT 可以充当一种促吞噬信号。细胞表面CRT 将促吞噬细胞信号传递至巨噬细胞，并且它已被证明是巨噬细胞吞噬的重要调节因子[20]。有研究表明，利用组织转换、肿瘤免疫监测和造血干细胞模型，使巨噬细胞检测和识别合适的具有调节巨噬细胞介导的程序性细胞清除（PrCR）的亚基聚糖位点的靶细胞，从而发挥程序性细胞清除反应。CRT 作为一种“危险信号”，在表达CRT 的白血病小鼠中观察到了强效免疫介导的对AML 的控制或排斥反应，结果表明其促进了与诱导白血病特异性T 细胞免疫相关的宿主Ⅰ型干扰素反应。CRT 暴露在细胞表面对化疗诱导的免疫原性细胞死亡是必不可少的，只激活自噬而不引起ER 应激的化疗药物不能增加Eco-CRT。因此，联合使用自噬激活剂和ER 应激诱导剂可以有效地促进CRT 向质膜的易位[21]。在MCF-7 和MDA-MB-231 细胞中CRT 的过表达对自噬没有影响，但值得注意的是，TSP 处理和CRT过表达的组合显著诱导MCF-7 异种移植物中的自噬。此外，体外重组TcCRT 的黑素细胞，可以促进人C1q 的掺入和巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。CRT 还可以为DC 或其他APC 提供促吞噬信号，且CRT 可以作为免疫佐剂，将自身和TAA 转移到细胞表面，诱导特异性的抗肿瘤免疫反应[22]。CRT 的磷脂结合位点是凋亡细胞上CRT 在细胞表面表达的关键锚点，并且CRT 充当PS 桥接分子，与其他PS 结合因子协同以促进凋亡细胞的吞噬作用。总之，CRT 在肿瘤细胞吞噬中发挥着重要的作用。

8 CRT可作为一种癌症诊断分子标记及抗癌治疗靶标

CRT 可以作为生物分子标记去预测及治疗相关的免疫反应。在某些条件下，CRT 既是一种潜在的可能有助于检测恶性OSCC 细胞表型的生物标志物，又是一种可以作为肺癌诊断和预测的分子标记。多因素分析表明CRT 的表达是晚期NB 患者的预测因子[23]，尿道膀胱肿瘤的CRT 对膀胱尿路上皮癌细胞的诊断具有重要作用。CRT 表达水平的改变可能影响膀胱癌在体内外的发展阶段，对CRT 进一步的研究可能对发现用于癌症化疗的新的药物靶标是有效的。例如，CRT 与MEK/ERK通路相互作用可能为胰腺癌的基因靶向治疗提供新的方法[24]。MHC CIITA 主要调控MHCII 类分子的表达，也诱导Ⅰ类分子的表达，携带CRT/E6的CIITA DNA 与Ii-PADRE DNA 的组合疫苗在临床使用中表现出潜在的抗肿瘤作用。另外，CRT的暴露可增加肿瘤细胞的免疫原性。例如，携带有人CRT-E6-E7-L 2 DNA 的疫苗诱导了一种具有潜在的E6/E7 特异性的CD8+T 细胞免疫应答反应，从而对持续表达E6/E7 的肿瘤细胞造成明显的治疗效果。在新的研究中，携带有CRT/E7 的pNGVL4a 疫苗对处于HPV16+CIN2/3 期的患者有良好的耐受性和较高的免疫应答[25]。通过对小鼠的实验研究发现DC 细胞封锁或拆卸CRT 可以抑制被蒽环类抗生素处理的肿瘤细胞的吞噬作用及免疫原性。这些数据表明CRT 可以为抗肿瘤免疫反应及免疫原性化学治疗提供可能的策略。同时，CRT 可以作为多种肿瘤的分子标记，甚至可以成为肿瘤治疗的靶标。

综上所述，CRT 与肿瘤的增殖、分化、凋亡、迁移、吞噬密切相关，可以作为一种潜在的癌症诊断分子标记及抗癌治疗靶标。