外泌体在糖尿病中的研究进展

王丽萍，冯尚勇，余果，宋斌，陈晖，张真稳，闫彩凤，潘云龙

外泌体在糖尿病中的研究进展

王丽萍，冯尚勇，余果，宋斌，陈晖，张真稳，闫彩凤，潘云龙

225001 江苏，扬州大学临床医学院/江苏省苏北人民医院生物样本库（王丽萍），内分泌科（冯尚勇、宋斌、陈晖、张真稳、闫彩凤、潘云龙），药物临床试验机构（余果）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由遗传因素和环境因素共同导致的一类代谢性疾病[1]。由于糖尿病的高发性和严重性，在世界范围内，糖尿病及其各种并发症已成为威胁人类健康的第三大杀手[2]。近年来，随着生活方式的改变和人口老龄化的加剧，我国糖尿病的发病率逐年增加，目前我国糖尿病的患病率已达总人口的9.7%[3]，因此早期诊断并给予有效治疗对于延长糖尿病患者生存期和提高生活质量至关重要。外泌体是由多种细胞在生理病理情况下经过“内吞-融合-外排”等调控过程所分泌的大小均一、直径 30 ~ 100 nm的双层膜包裹的球状或杯状囊泡。外泌体可携带多种信号分子和生物活性物质并参与机体免疫、细胞间通信、细胞增殖、细胞迁移、细胞分化以及代谢性疾病的发生发展过程[4]。本文主要对外泌体的生物学特性和功能以及在糖尿病及并发症中的研究进展进行总结综述，旨在为糖尿病的诊治提供新思路。

1 外泌体的基本概念

1983年，外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中[5]，以细胞管腔内囊泡的形式存在。外泌体密度为 1.10 ~ 1.18 g/ml，电镜下呈扁形、球形或杯状，在体液中主要呈球形结构。外泌体是细胞内吞过程的末端产物，细胞的胞吞形成带有外源性抗体的内体小泡（intraluminal vesicls，ILVs），在高尔基体等细胞器的作用下形成早期核内体（early endosomes，EEs）。EEs 的囊膜不断内陷，并选择性地接受细胞内的蛋白质、核酸、脂类等生物活性成分，最终形成晚期核内体（late endosomes，LEs）。LEs 与细胞膜融合，将外泌体释放至胞外环境[6-7]。外泌体中携带丰富的蛋白质，一种为普遍存在的蛋白成分，主要包括肌动蛋白、微管蛋白、热休克蛋白等细胞骨架蛋白，Rab、Alix、Flotillin 和 TSG101 等膜转运蛋白和融合蛋白，以及 CD9、CD81、CD63 等内体转运相关的四跨膜蛋白等[8]；另一种为具有细胞特异性的蛋白成分，如CD3 分子由T 细胞来源的外泌体所携带[9]，血小板来源的外泌体含有特异性的血友病因子和整合蛋白CD41a[10]，神经元分泌的外泌体含有谷氨酸受体[11]等。此外，外泌体携带的 DNA、mRNAs、miRNAs、lncRNAs 等核酸分子与受体结合从而介导胞内信号调控，改变细胞功能。外泌体可通过与邻近细胞的胞膜发生融合，或通过转运蛋白质、脂质等直接激活靶细胞，使靶细胞发生一系列生物学效应。

2 外泌体与糖尿病

2.1 外泌体与 1 型糖尿病

1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是一种特殊的自体免疫性疾病，主要诱因包括遗传因素、外源性感染性病原体、非感染性环境因子、内源性抗原和生理应激等。T1DM 的潜在自体免疫过程一般发生在临床糖尿病发病前，正是这种无症状期为疾病的预测和预防提供了绝佳的机会。外泌体在T1DM 胰岛的自体免疫反应中起着非常重要的作用[12]。研究发现，抗原递呈细胞（APC）来源的外泌体含有大量的主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）分子，可以激活 T 淋巴细胞产生免疫应答，进一步激活 B 淋巴细胞启动体液免疫，两者共同作用并高度特异性地对胰岛 B 细胞产生自体免疫性攻击，导致 β 细胞减少，最终因胰岛素分泌不足而引起血糖升高及糖尿病[13-14]。

外泌体转运可作为多种疾病及并发症的生物标记物，包括 T1DM[15]、肾病[16]或视网膜疾病[17]等。Garcia-Contreras 等[18]对 12 例 T1DM 组和 12 例对照组患者血浆样本进行外泌体 miRNA 芯片检测，结果显示有 7 个 miRNAs 在两组中存在显著差异，其中上调的为 miR-16-5p、miR-302d-3p、miR-378e、miR-570-3p、miR-574-5p、miR-579；下调的为 miR-25-3p。通过 RT-qPCR 验证，对照组 miR-16-5p 和 miR-574-5p 明显高于 T1DM 组（< 0.05，< 0.01）。该研究首次揭示，从患者血浆外泌体中分离出的 miRNA 有望作为 T1DM 诊断的潜在生物标记物。相比于传统生物标记物，外泌体具有独特优势，原因包括：①采集方便，可以很容易地从血液、尿液、唾液、腹水等多种体液中提取；②相对稳定，可以长期储存在–80 ℃；③敏感性高，可提供蛋白酶/核酸酶控制环境，提高分子稳定性；④有利于分离粒子的特殊分子浓度；⑤特异性高，可以使用特定的抗细胞表面标记抗体进行分离，然后对特定的转运蛋白/RNAs4 进行分析，这些特征使其在临床诊断应用中更具吸引力。

2.2 外泌体与 2 型糖尿病

随着人类生活水平的提高，2 型糖尿病（type 2 diabetesmellitus，T2DM）的发病预计可达 6.4 亿，并在全球范围内呈逐年增高趋势，其主要病理生理学变化为胰岛素抵抗和β 细胞功能缺陷[19]。胰腺 β 细胞功能障碍引起胰岛素抵抗从而降低胰岛素的敏感度和生成量，最终导致T2DM。

脂肪因子是由脂肪组织释放的多种生物活性蛋白质和多肽组成，复杂的蛋白结构改变提示其在多因子疾病和新陈代谢病理生理中发挥着重要的作用。脂肪酸结合蛋白 4（FABP4）能够结合并转运细胞内的脂肪酸，缺乏 FABP4 基因的 ob/ob 小鼠表现出胰岛素敏感性增强，葡萄糖耐量和脂肪代谢改善等特征[20]。提示 FABP4 在糖尿病发病中起着关键性作用。而有研究发现，在脂解增强的情况下，FABP4 可通过外泌体途径分泌增加[21]。肥胖患者体内表现为脂解作用增强，外泌体途径分泌的 FABP4 增加，加重机体胰岛素抵抗，从而导致高血糖和糖尿病。当血糖急性升高、胰岛素需求增加时，miRNA 可引起 β 细胞增殖，从而增加胰岛素的分泌。有研究发现，外泌体可在 miRNA 水平导致β 细胞凋亡增加。Guay 等[22]用干扰素 γ、TNF-α 和 IL-1β 处理MIN681 细胞后所产生的外泌体来孵育 MIN681 细胞和小鼠的胰岛细胞，发现 MIN681 细胞和小鼠的胰岛细胞凋亡明显增加。然后，检测外泌体内 miRNA，其中 miRNA-146a、miRNA-146b、miRNA-497、miRNA-195 等差异性表达与细胞凋亡相关。

2.3 外泌体与糖尿病肾病

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者最重要的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病的首要原因。目前临床上尚无有效的防治手段，随着分子生物学等技术的发展，外泌体在 DN 发病中的作用慢慢揭开神秘面纱，成为重要的新型临床诊断标记物并提供潜在的治疗靶点。

姜珍珍[23]采用 STZ 构建1 型 DN 大鼠模型，研究人的尿液来源外泌体对 T1DM 大鼠肾脏的保护作用，结果显示：①新鲜尿液中可成功分离出外泌体，并检测到 CD9、CD63 和 CD81 相对保守的表达；②同正常组相比，DM 组的大鼠尿量和尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UACR）显著性升高（< 0.05），而 DM+ 外泌体组的 UACR 值明显减少，且未达到 DN 的微量白蛋白尿标准，表明外泌体能改善糖尿病大鼠 UACR。进一步研究证实，尿液来源的外泌体可减少肾小球系膜增生，改善肾脏功能，减少组织细胞的凋亡从而延缓 DN 的发生发展。Zubiri 等[24]研究证实，与正常小鼠相比较，DN 小鼠的尿液外泌体中钙调素（RGN）和衰老标志蛋白（SMP-30）显著下降，结果提示其可作为 DN 的早期诊断和病情进展监测的新生物标记物。2017 年，罗艳和胡桂英[25]采用 miRNA 芯片技术，研究 T2DN 患者尿液外泌体中miRNA 的表达谱变化，结果显示 DN 组与 T2DN 组尿液外泌体 miRNA 存在显著差异，并预测表达最为明显的 miR-320c 可作为评估 DN 进展的一种新的标记物，其具体机制可能通过靶蛋白血小板反应蛋白1（TSP-1）/转化生长因子（TGF-β）信号转导通路而发挥作用。相关性分析发现其与疾病发生的严重程度明显相关，进一步阐明了尿液外泌体所携带的信息能够反映 DN 的病理生理变化。

2.4 外泌体与其他糖尿病并发症

血糖升高可使心肌肥大、细胞凋亡和纤维化加重，当肥大的心肌失代偿时，可发生心力衰竭。因此，多数糖尿病患者伴有不同程度心肌损伤，且糖尿病引起的心肌梗死和细胞死亡是导致糖尿病患者死亡的主要原因。Davidson 等[26]从糖尿病大鼠中分离心肌细胞，经缺氧复氧处理后，死亡率从（24 ± 1）%明显增加到（63 ± 4）%，然后用从非糖尿病大鼠中分离的外泌体进行预处理，死亡率明显降低至（29 ± 3）%。该研究表明来自健康个体的外泌体可用于保护糖尿病个体的心肌细胞。而且也有研究发现，外泌体可保护 T2DM 大鼠心肌缺血、缺氧再灌注损伤，说明外泌体在糖尿病心肌损伤中产生有利作用[27]。Chaturvedi 等[28]发现，运动可通过促进心肌细胞释放外泌体来减轻糖尿病性心肌病患者心肌纤维化，这种外泌体携带的 miR-455 和 miR-29b 水平升高，进而下调MMP-9 的表达，可以防止糖尿病患者心肌纤维化和解耦联。并有报道指出，间充质干细胞来源的外泌体（mesenchymal stem cell derived exosome，MSC-Exo）通过 Smad2/3 信号通路抑制高糖诱导的成纤维细胞的转分化，且进一步证实高糖能通过 TGF-β1/Smad2/3 信号通路促进成纤维细胞增殖，加速纤维化进程，最终导致糖尿病病理生理学改变[29]。因此，了解外泌体靶向传递和清除机制，有可能为糖尿病心肌损伤提供新的治疗方法。但是，目前对外泌体在糖尿病心肌损伤中的作用机制尚未完全明确，而且高糖环境对外泌体分泌的影响机制尚不清晰，需要进一步深入研究。

糖尿病足增加了糖尿病患者感染和截肢的风险，可将5 年死亡率增加到 80%[30]。血管内皮干细胞功能受损和衰老以及高糖诱导的 ROS 可能加重糖尿病足。有研究发现，脂肪来源干细胞分泌的外泌体可促进血管内皮干细胞在高糖环境下的增殖和血管生成，而且该研究表明脂肪来源干细胞分泌的外泌体可使创面肉芽组织形成、血管生成、生长因子表达水平增加，同时使炎症和氧化应激相关蛋白水平降低[31]。另外，Guo 等[32]观察利用富血小板血浆分泌的外泌体治疗糖尿病大鼠慢性创伤的皮肤，发现富血小板血浆分泌的外泌体能有效诱导内皮细胞和成纤维细胞增殖和迁移，改善慢性创伤血管生成和再上皮化。

目前，外泌体在糖尿病并发症（包括糖尿病足、糖尿病视网膜病变、糖尿病心脏病、糖尿病周围神经病变等）方面的研究还比较少。需要进一步深入研究，为糖尿病并发症的治疗提供新的方法。

3 展望

随着靶向治疗技术的发展，外泌体作为糖尿病诊断和预后的生物标记物已经显现出巨大潜力。糖尿病患者的血液、尿液中均可以分离得到大量外泌体，采集过程简单无创、高度灵敏和高度特异，可作为精准医学临床诊断和预测预后的理想生物标记物。目前存在外泌体的提取过程繁琐、纯度过低、所需试剂耗材费用昂贵等系列问题，应尽快建立标准化、规范化外泌体检测平台加快外泌体大样本大数据的临床转化，为糖尿病的诊断和治疗提供新方向。

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潘云龙，Email：NJPHWLP@163.com

2019-05-09

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.014