CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肿瘤免疫治疗中的应用

张雨，王可洲，郭中坤，聂爱蕊

CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肿瘤免疫治疗中的应用

张雨，王可洲，郭中坤，聂爱蕊

250200 济南大学/山东省医学科学院医学与生命科学学院（张雨、王可洲、郭中坤、聂爱蕊）；250002 济南，山东省实验动物中心/山东第一医科大学（山东省医学科学院）（张雨、王可洲、郭中坤、聂爱蕊）；276023 山东，临沂市第三人民医院药剂科（聂爱蕊）

肿瘤的治疗依旧是医学上的难题，由于其发生发展复杂，往往伴随着免疫逃逸和免疫抑制性肿瘤微环境的形成，且肿瘤细胞易于扩散和迁移[1]。因此，阻止肿瘤细胞的免疫逃逸是一项重要的治疗途径。肿瘤免疫治疗是指通过增强特异性免疫细胞对肿瘤的防御能力，并阻遏其他调节性免疫细胞对肿瘤的保护作用[2]，从免疫防御的角度来控制肿瘤细胞的生长及扩散。肿瘤免疫疗法的出现备受关注，是癌症治疗领域的最具前景的研究方向，更多的肿瘤免疫治疗药物已进入临床试验阶段及市场，使癌症的治疗有了新的选择。另外，为加强 T 细胞的特异性免疫原性而对其进行基因修饰以提高其对肿瘤细胞的杀伤作用的研究方法已取得了重大的进展[3]。

基因编辑技术是对某一核苷酸序列中的特定基因位点进行人为改变，插入、删除、替换或修饰基因组中的特定目的基因使其表达性状改变的一种新兴分子生物技术[4]。簇状规则间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/ CRISPR 相关基因 9（CRISPR-associated genes 9，Cas9）作为一种新兴的基因编辑技术，具有简单高效的靶向基因编辑能力，被广泛应用于肿瘤治疗领域[5]，并极大促进了肿瘤免疫治疗研究的发展。本文就 CRISPR/Cas9 技术的背景、原理及此基因编辑技术在肿瘤免疫治疗方面的应用进行综述，讨论基因编辑技术在此领域的研究进展。

1 CRISPR/Cas9 基因编辑原理

CRISPR/Cas 系统是一种普遍存在于古细菌和细菌基因组中的适应性免疫系统[6]，其序列特点最先于 1987 年由日本学者发现。直到 2008 年该系统才被研究证明能够以类似于真核细胞中 RNA 干扰（RNAi）的方式抵御外源微生物或质粒的侵袭[7]。2012 年，由 RNA 介导的基因组编辑技术 CRISPR/Cas9 正式建立，并完成了在哺乳动物细胞中的基因组编辑[8]。

CRISPR/Cas9 基因编辑系统是根据II型原核生物的 CRISPR/Cas9 系统演变而来[9]。Cas9 蛋白能够结合人工改造的单链向导 RNA（single guide RNA，sgRNA）形成核糖核蛋白，在 sgRNA 的引导下靶向识别基因组的目标系列[10]。传统的噬热链球菌改造出的 spCas9 蛋白需要基因组靶目标序列上游存在NGG（其中 N 为任意核苷酸）的前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）的结构序列[11]。Cas9-sgRNA 与基因组靶标序列形成三元复合物之后，Cas9 蛋白的两个 DNA 酶结构域能够切割 DNA 的磷酸酯键，最终形成的双链断裂损伤（double stranded break，DSBs）会激发细胞自身的两种 DNA 损伤修复机制：同源重组修复机制（homology directed repair，HDR）和非同源重组末端直接连接修复机制（non-homologous end joining，NHEJ）[12]。HDR 修复一般是在外源同源供体 DNA 存在的前提下对 DSB 进行同源重组修复，人工设计外源的单链或双链供体 DNA 可以敲入和辅助大片段敲除靶标序列或构建点突变[13]。NHEJ 修复途径不依靠同源重组方式，而是依靠相关蛋白介导直接断裂双链直接连接修复，但易产生插入缺失突变或移码突变，非同源重组末端直接连接修复机制途径是常用的对蛋白质编码基因进行敲除的修复途径[14]。CRISPR 基因编辑技术出现后便很快地被应用于多种细胞水平和模式生物个体水平中的基因编辑，利用 CRISPR/Cas9系统并结合大规模库筛方法可实现对基因功能的快速筛选和研究[15]。

CRISPR/Cas9 技术作为第三代人工核酸内切酶技术，属于 Cas 系统中最便捷的技术。CRISPR/Cas9 基因编辑技术的编辑原理现在还没有明确的解释，但其编辑途径大致可分为三个步骤来完成[16]，首先是 CRISPR 高度可变的间隔区的获得，然后是 CRISPR 基因座的表达，最后是此 CRISPR/Cas9 编辑系统发挥活性或者是对外源遗传物质的干预。

以细菌抵抗外源微生物感染时的 CRISPR/Cas9 系统防御机制为例说明，主要有以下三个阶段[17]：①适应：CRISPR/Cas9 系统中的 Cas1、Cas2 协助其他相关 Cas 蛋白使外源微生物基因组中的某特定片段定点整合到 CRISPR位点第一个重复序列之前，前导区之后，在之后的复制中作为一个新的间隔序列存在；②表达：前导序列介导 CRISPR 转录为 pre-crRNA 时，其 5' 端的 tracrRNA 同时进行转录并通过碱基互补配对与 pre-crRNA 构成 RNA 二聚体，在Cas9 和RNAaseIII的协同作用下剪切成为成熟的 crRNA/tracrRNA 二聚体；③干扰：成熟的crRNA/tracrRNA 二聚体通过碱基互补原则识别外源微生物基因组中的靶目标位点，在 Cas9 蛋白核酸酶的引导下剪切该靶标位点的 DNA 双链结构，从而使外源微生物失活。

经过人工改造后的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的操作原理与此类似[18]，在形成 crRNA/tracrRNA 二聚体时的 crRNA 编码序列中被人为目的基因特定位点的序列替换，从而构建成能够介导 Cas9 蛋白定点切割目的基因 DNA 特定位点的sgRNA[19]。在 Cas9 蛋白剪切目的基因的 DNA 双链之后形成 DSBs，并激活细胞的 HDR 和 NHEJ 两种自我修复机制，从而实现对目的基因的插入、敲除及改造修饰等基因编辑方式。

2 CRISPR/Cas9 在抗肿瘤免疫治疗中的应用

2.1 CAR-T 细胞免疫疗法

CRISPR/Cas9 技术在肿瘤免疫治疗方面发挥着重要的作用，其在基因治疗上最大的突破是促进了肿瘤临床治疗的研究进展。在诸多肿瘤免疫疗法中，CAR-T 细胞免疫疗法是最热点的研究内容，其全称为嵌合抗原受体 T 细胞免疫疗法[20]。CAR-T 技术通过基因编辑获得修饰后的 T 细胞，能够特异性识别肿瘤细胞表面特异性受体，并增强其对肿瘤细胞的防御能力[21]。CAR-T 疗法是通过采集患者的 T 细胞进行基因修饰，成为 CAR-T 细胞后输入患者体内，过程用时长、难度高且成本大，还有 T 细胞自身的治疗数量限制[22]。而 CRISPR/Cas9 技术能明显提高 CAR-T 细胞的制备效率，首先对一个正常的免疫 T 细胞进行基因改造，在引入 CAR 序列时去除 T 细胞内源性 αβT 细胞受体基因和人白细胞抗原 I（human leukocyte antigen I，HLA I）类编码基因[23]，防止用于不同患者时产生抗宿主反应。另外，CRISPR/Cas9 技术也可以通过敲除编码信号分子的基因或 T 细胞抑制性受体的基因来提高 CAR-T 细胞的功能。CAR-T 细胞疗法的抗肿瘤疗效显著，但只能够特异性识别肿瘤细胞表面受体，而肿瘤特异性 T 细胞受体（TCR-T）细胞能够通过基因修饰表达特异性受体，识别肿瘤细胞表面经 I 类主要组织相容性抗原呈递的抗原肽从而识别胞内特异性分子[24]。但受体 T 细胞中存在的内源性 TCR 与修饰后的 TCR 可能会存在竞争反应，因此采用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术制备 TCR、HLA I 类分子和 PD1 缺失的 CAR-T 细胞，使其异体反应降低又不引起抗宿主疾病，体内抗肿瘤疗效也得以提升。

CRISPR 技术在应用于 CAR-T 细胞的基因修饰方面，具有广阔的应用前景。但存在两个限制性问题[25]：一是 CRISPR 技术导入 T 细胞的方法不能使普通细胞正常增殖，限制了细胞培养和富集过程。导入方法中，非整合转染方法虽安全但效率低，整合转染的方法效率较高但其安全性不能保证。二是 CRISPR 编辑系统存在脱靶现象，一旦发生脱靶，将导致非靶标基因的改变或调控元件的破坏，会造成不可逆转的后果。因此 CAR-T 细胞的精确编辑和高效导入是基因编辑技术未来主要的研究方向。

2.2 免疫检查点阻断疗法

程序性死亡分子 PD-1 和细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）等免疫分子的变化影响 T 细胞的活化，使肿瘤细胞易于逃逸机体免疫机制，导致 T 细胞治疗效果较差。为了更好发挥 T 细胞肿瘤治疗的疗效，利用免疫检查点的阻断抗体可阻断免疫调节物对 T 细胞的免疫应答抑制[26]，有效提高其免疫功能。另外，通过 CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除参与免疫负调节的基因，达到同样的抗肿瘤效果，是一种全新的治疗思路。利用电穿孔方法[27]将 Cas9 和 sgRNA 导入 T 细胞并敲除 PD-1 基因，使其表达减少，长时间的体外培养过程中没有发现 PD-1 对 T 细胞活化的影响，使 T 细胞更好地发挥其抗肿瘤疗效。这种新的阻断疗法常常与过继性 T 细胞免疫疗法结合使用[28]，可以增强免疫细胞的活性。科学家运用 CRISPAR /Cas9 技术有效地对 CAR-T 细胞进行基因编辑，得到多基因敲除 CAR-T 细胞，防止免疫调节物对 T 细胞活化与增殖的影响，成功提高 CAR-T 细胞对免疫细胞的防御作用，更好地发挥抗肿瘤疗效。

2.3 抗体靶向疗法

正是因为肿瘤细胞表面表达了与正常细胞不同的抗原，因此这些抗原可以作为单克隆抗体识别的靶点，被抗体识别并结合，引起肿瘤细胞的死亡，从而达到抗肿瘤的目的。目前，FDA 已批准的抗体类药物有许多，如抗 HER2 抗体、抗 CD20 抗体、抗 VEGF 抗体等。CRISPR/Cas9 基因编辑技术可以用来鉴定肿瘤细胞表面的潜在特异性靶点，进一步发展抗体的靶向治疗应用。Steinhart 等[29]利用CRISPR/Cas9 技术在具有 RNF43 突变的胰腺导管肿瘤细胞之间进行全基因组筛查，发现 Frizzled-5 受体在胰腺肿瘤细胞的生长中起着关键作用。特异性结合 Frizzled-5 的抗体能够明显抑制荷瘤小鼠中癌细胞的增殖，表明 Frizzled-5 或成为免疫治疗药物研究的新方向。

另外，CRISPR/Cas9 不仅可以鉴别肿瘤细胞表面特异性靶点，同时也在抗体的制备中发挥着作用。根据抗体重链 C 区氨基酸组成不同，对应的抗体可分为 IgG、IgA、IgM、IgD 和 IgE 五类，在激活补体系统、激活效应细胞以及对靶细胞的杀伤作用方面这五类抗体均存在差异，在肿瘤的抗体靶向治疗中也起着不同的作用。因此，抗体类型转换使抗体多样化，更多地应用于抗体的靶向治疗[30]。B 细胞特异性胞苷去氨酶（AID）参与了抗体类别转换的过程，Ig 基因发生类别转换最重要的步骤是 DNA 双链的断裂[31]，断裂一般是由 B 细胞特异性酶如重组激活基因蛋白 1/2（RAG 1/2）和 AID 启动。研究者们运用 CRISPR/Cas9 技术编辑了人类和小鼠的 Ig 基因，利用 CRISPR/Cas9 介导的IgM+小鼠 B 细胞、杂交瘤细胞及人的 B 细胞重链恒定区基因高效 DNA 断裂，故发生类别转换重组，实现IgM-IgG-IgA 的抗体类型转换[32]。通过 CRISPR/Cas9 技术，可靶向编辑杂交瘤细胞或者 B 细胞免疫球蛋白重链恒定区的基因，获得特定类别的抗体，达到抗肿瘤的目的。

抗体的抗原结合片段（Fab）分子量小，更易渗透进入肿瘤组织，在肿瘤的抗体靶向治疗中起着关键作用。因此有研究为了获得只分泌抗体 Fab 片段的杂交瘤细胞，利用CRISPR/Cas9 技术删除小鼠杂交瘤细胞的 Fc 段的基因，便可以更为高效简便地获得抗体的 Fab 片段，并易与其他药物偶联进而渗透入肿瘤组织，抗肿瘤效果更为显著。

3 小结

CRISPR/Cas9 系统编辑基因的高效性及简便性大大地推动了临床医疗及生物领域的发展与研究，特别是在抗肿瘤免疫治疗中，该基因编辑技术通过定向敲除肿瘤免疫检查点分子或者通过快速简便的基因编辑，推动了抗肿瘤免疫治疗的研究进展，并明显降低了肿瘤免疫治疗的操作难度。然而，由于 CRISPR/Cas9 技术操作过程中存在脱靶效应以及细胞内递送效率低的问题，其在临床治疗上的应用存在限制。

首先是系统的脱靶效应，基于 CRISPR/Cas9 的 DNA 单碱基编辑技术可以降低基因脱靶效应，但却增加了技术的实际操作难度[33]。研究表明，Cas9 蛋白的高强度长时间的表达会显著增加 CRISPR/Cas9 的脱靶效应发生率，通过调节光照可以间接调控 Cas9 的活性，从而抑制其高强度的表达并减少其非特异性切割，明显降低脱靶效率。另外，多种病毒载体如逆转录病毒载体等，也能够将基因编辑时的脱靶效率降到最低检出限以下[34]。其次是 CRISPR/Cas9 操作系统在细胞内的递送效率问题。常规方法不易完成针对免疫细胞的高效转染，因此常通过电穿孔的方法将 CRISPR/Cas9 质粒转入细胞内，但是该方法对细胞损伤较大，致使细胞的活力下降，往往达不到预期的治疗效果。因此，如何在不影响 CRISPR/Cas9 的简便性和高效性的同时又可以有效地降低其脱靶效应发生率，提升其对免疫细胞的转染效率，达到理想的抗肿瘤免疫治疗效果，科学家们也在积极努力。2015 年，麻省理工学院的张锋团队在 CRISPR/Cas9 技术的改进方面取得了重大进展，在来自细菌的蛋白酶中，他们发现了一个能够阻止病毒入侵并可以编辑核酸序列的蛋白酶 Cpf1，能够识别 T 碱基较多的序列，扩大了可编辑的基因范围[35]。同时，Cpf1 能够处理 crRNA 前体，且分子量更小，从而减少了针对靶向序列 gRNA 的设计工作，提高了编辑效率和编辑成功率。2018 年，有科学家对spCas9 进行改进，通过噬菌体辅助持续化技术筛选得出 spCas9 的一个突变体 xCas9，可以识别多位点，并且 xCas9 的特异性要高于 spCas9，有效降低了脱靶效率，已被成功地运用在基因治疗等方面[36]。

综上，CRISPR/Cas9 基因编辑技术在抗肿瘤免疫治疗中担任着重要的治疗角色。相信通过科学家们的努力，对此技术进行进一步的完善，将会使其更加广泛地应用于基因研究，促进抗肿瘤免疫的临床治疗。

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国家重点研发计划（2017YFD050160202）；山东省医学科学院医药卫生科技创新工程；山东省自主创新及成果转化重大专项（2012ZHXA0419）

王可洲，Email：wangkezhou_cn@163.com

2019-03-13

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.012