鱼类抗菌肽研究进展（一）

刘洪岩，薛晖，张世勇，王江，赵沐子，陈校辉，边文冀

（江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017）

抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的高度保守的多肽，在体外和体内都表现出广谱抗菌活性。抗菌肽最早在两栖动物中发现，随后在兔和人类中发现[1]。鱼类中发现的最早的抗菌肽是1980年从美洲鲽中发现的，但直到1996年后才有突破性的进展，目前鱼类抗菌肽研究已取得与其他脊椎动物物种相同的进展，发现了piscidin家族（鱼类特有的抗菌肽，与天蚕抗菌肽同源），以及防御素、cathelicidin、hepcidin家族[2]。鱼类的抗菌肽表现出许多与他脊椎动物抗菌肽相同的特点，如广谱的抗菌活性和免疫调节功能。此外，鱼类抗菌肽表现出独特的适应水生环境和微生物的特异性，因此，类抗菌肽在人类医学和水产养殖中都具有成为治疗剂的潜力。

1 Piscidins

Piscidins是一类线性、两亲性抗菌肽，进化上与两栖类动物和昆虫抗菌肽相似[3]。在美洲拟鲽皮肤分泌物中发现的一种25个氨基酸的抗菌肽pleurocidian，是该家族发现的第一个成员。随后，在其他相关物种中发现与pleurocidins同源的抗菌肽[4]。这些抗菌肽都是两亲性，类似于爪蟾抗菌肽天蚕素。在泥鳅中发现的piscidins被称为misgurin[5]，在杂交条纹鲈[6]肥大细胞中发现的Piscidins称为piscidian。其他类似的肽，包括 moronecidin，epinecidin，dicentracin，通过对其成熟肽的二级结构以及基因结构的预测，发现他们都属于同一个进化相关的家庭，因此将其称为piscidins。

从氨基酸序列比对来看，piscidins家族有1个保守序列，也就是其双亲性的α-螺旋结构[3]。他们的基因由四个外显子和3个内含子组成，编码1个含有1个信号肽肽前体，成熟肽和1个羧基末端结构域[8]。

Piscidins主要在鳃、皮肤和肠表达，在头肾和脾脏中有少量表达[9]。然而，大西洋鳕鱼的软骨、心脏、卵母细胞、外分泌和内分泌腺体，鱼鳔和其他组织中均有表达，不同的部位表达不同的亚型[10]。此外，表达piscidins的主要是存在于不同组织的的肥大细胞，小粒细胞，吞噬细胞和嗜酸性粒细胞[11]。粒细胞的吞噬体可以通过细胞内分泌的piscidins杀伤细菌，这说明Piscidins可以通过参与胞内和胞外的免疫应答来杀伤细菌[10]。此外，比目鱼中，piscidins在孵化后13 d开始表达，说明Piscidins在个体发育中起到重要作用[12]。

像哺乳动物的抗菌肽基因一样，各种刺激，包括革兰氏阳性和阴性菌，细菌细胞成分LPS[11]或细菌抗原ASAL[9]都会引起鱼类抗菌肽基因的表达。LPS介导斑马鱼epinecidin-1基因表达，需要肝细胞核因子1的参与。此外，鱼类的piscidins基因表达，可以由寄生虫、病毒和聚肌胞引起[11]。另一项研究表明，高生物量密度作为一种急性应激方式，会导致上调鳃和皮肤上调表达dicentracin[13]。

Piscidins具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性菌和阴性菌都有杀伤性，对几种链球菌、假单胞菌、芽孢杆菌和弧菌都具有抗性。Piscidins也被证明具有抗真菌活性[6]，抗寄生虫活性[11-12]和抗病毒活性。研究表明，piscidin-2是能够有效抑制水霉[8]。

除了微生物，piscidins还具有介导或杀死肿瘤的活性，能够被piscidins抑制的细胞系包括A549细胞系，HT1080 细胞、U937、HL60、U937、HeLa[14]以及不同乳腺癌细胞系[15]。此外，pleurocidin能够通过损伤线粒体膜和释放ROS杀死NOD SCID小鼠乳腺癌移植瘤[22]；piscidins还可以通过破坏癌细胞的细胞膜来杀死癌细胞[14]。

Piscidins通过细胞膜“打孔”的方式导致细胞物质流出，人工膜模型证明，piscidins的膜定位能力，影响其裂解细胞的能力。此外，使用特定的高分辨率的固态NMR和圆二色谱结果表明，piscidin-1和-3诱导的膜与piscidins相互作用发生在模型表面的α-螺旋方向并且是平行面快速的、大幅度的骨干运动[16]。当piscidins浓度低时，不会造成明显的抑制与细胞膜损伤，但能够抑制细菌大分子的合成。通过对原生质体再生和细胞膜破坏，造成氧化应激，诱导细胞内活性氧（ROS）释放，激活metacaspases，导致磷脂酰丝氨酸外翻，从而引起真菌和白色念球菌凋亡[17]。

Piscidins的免疫调节能力是他的另外一个重要特性。在鱼类中，它们能够调节促炎和其他免疫相关基因的表达，如 IL-1β、IL-10、TNF-α、IL-22，IL-26，IFN-γ，NF-κB，溶菌酶，NOS2，MyD88，TLR4a，TLR1、TLR3。还有一些piscidins能够刺激人体肥大细胞的趋化性增加，Ca2+动员以及诱导促炎性细胞因子（如CCL2，1β/CCL4）的产生，释放白三烯和前列腺素D2[18]。

总体看来，piscidins是一种进化上非常保守的抗菌肽家族，在鱼类中表现出广泛的同源性，并且在许多其他物种中也有同源抗菌肽种类存在。

2 β-防御素

β-防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽，在植物、真菌、无脊椎动物和脊椎动中都有发现，防御素具有保守的半胱氨酸构成的稳定螺旋和β-折叠。在哺乳动物中，根据防御素的结构可以分为三种，α-防御素，β-防御素，和θ防御素[19]。在鱼类中，序列分析和结构分析表明，鱼类的防御素只有β-防御素样蛋白[20]，含有保守的6-半胱氨酸结构域。到目前为止，在一个单一物种中发现过多达四个基因，这显然是在脊椎动物防御素基因复制的结果[22]。人类和鱼类的防御素进行进化分析结果表明，人类防御素中仅有HBD-4能够与鱼类防御素聚为一支，因此鱼类防御素可能与HBD-4具有相似的生物学特性[20]。

人防御素基因有两个外显子和一个内含子，防御素被翻译后，即为成熟的抗菌肽[21]。在鱼类中，防御素基因包含3个外显子和两个内含子，编码的蛋白前体（包括信号肽、前肽和成熟肽），由60到77个氨基酸组成，成熟肽则是由38到45组成的阳离子肽，等电点在8左右（除了牙鲆防御素，等电点是4左右，具有阴离子抗菌肽的性质）。

鱼β-防御素已被证明能有效对抗革兰氏阴性和阳性细菌，但是活性较弱，MIC值比较高。使用β-防御素转染过的HEK293T细胞的裂解液，能够显著提高泥鳅或金头鲷防御嗜水气单胞菌和枯草杆菌的能力[23]。β-防御素对特定的病毒，如新加坡石斑鱼虹彩病毒，病毒性神经坏死病毒，出血性败血症病毒均表现出杀伤活性。有研究表明，人类-防御素-1（HD-1）是能够使鲑鱼弹状病毒失活[24]。

除了其抗菌活性，防御素还具有多种免疫调节活性。例如，金头鲷防御素具有趋化活性，能够趋化斑马鱼头肾白细胞，其作用机制可能是斑马鱼中有CCR6同源基因[25]。另外，大西洋鳕鱼防御素能够刺激吞噬细胞抗菌活性[26]。

只有少数防御素（主要是HBD-1及其同系物）是组成型表达的，大多数防御素表达是后天的，其表达可由多种因素引起的，其中包括许多先天免疫介质和病原相关分子模式[27-29]。鱼β-防御素基因通过各种刺激因子诱导表达，包括细菌细胞壁成分脂多糖，β-葡聚糖和肽聚糖。此外，作为饲料添加剂硅藻naviluca sp.和乳酸菌Lactobacillus sakei能够诱导的金头鲷β-防御素表达[30]。综上所述，鱼类防御素是哺乳动物同源的、具有类似结构和功能以及表达方式的多肽。这进一步证明了β-防御素是一个高度保守的、古老的宿主防御机制。