ELISA 在基层兽医实验室遇到的问题及解决方法

张丽燕

（吉林省梅河口市动物疫病预防控制中心 135000）

酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）最早出现于1971 年的Engvall E 等进行的 IgG 定量测定中，随后ELISA 以其操作简便、样品容量大、仪器化程度高、检测成本低、灵敏度高等优点迅速发展成为一种新型免疫酶标记技术，在疫病诊断、食品安全、兽药残留等领域均显示出了良好的应用前景[1.2]。当前几乎所有的动物疫病都已经研制或正在试图研制ELISA 试剂盒，ELISA 在基层兽医实验室中得到广泛和普遍应用。尽管ELISA 方法操作简单，但ELISA 在实际操作过程中涉及的环节较多，在兽医临床实际应用过程中如果对ELISA 方法的试验原理不够理解或者对ELISA 方法的操作不太熟练，且受到试验条件、人为操作、环境因素等影响，极易出现假阴性、假阳性等问题，直接影响检测结果的可靠性与准确性[3]。本文就基层兽医实验室在应用ELISA 方法进行检测中遇到的各种问题和解决方法进行简要阐述和分析，对全面理解和科学掌握ELISA 方法、保障试验结果准确无误、提高试验人员操作水平、提升基层兽医实验室检测检验能力均具有重要的参考价值和指导意义。

1 ELISA 方法的基本原理

ELISA 方法的基本原理是基于酶分子与抗原或抗体分子的共价结合（即酶标记抗原或抗体分子），该共价结合即没有改变和降低抗原或抗体的免疫学特性，也没有改变和降低酶的生物学活性[4]。在进行检测时，首先利用抗原或抗体结合于固相载体表面，受检样品中抗体或抗原与固相载体表面的抗原或抗体发生特异性免疫学反应，再加入酶标记的抗原或抗体分子，最后通过加入与酶特异性反应的底物液后显色，根据显色后颜色深浅可判定酶量，而酶量与受检样品中抗体或抗原的量具有一定相关性，进而实现定性或定量分析。

2 常见问题分析

2.1 样品采集或处理方法不合适

血清样品采集过程中出现溶血，此时样品中可能含有过氧化物酶活性物质，此物质可以与酶标记的抗原抗体发生非特异性结合，改变底物显色颜色的深浅，造成假阳性或假阴性结果。血清样品处理过程中污染细菌，而部分菌体中含有内源性过氧化物酶，造成假阳性或假阴性结果。血清样品处理过程中如果经过冻融，抗体蛋白分布不均匀，吸取的样品未含有或少量含有抗体蛋白，造成假阳性或假阴性结果。

2.2 试剂盒质量下降

由于试剂盒生产厂家较多，市场上试剂盒的质量参差不齐，且同一生产厂家的不同批次试剂盒之间也存在较大差异，基层兽医实验室如果选择不合理，使用后造成检测结果不确定，检测结果的可重复性差。试剂盒在运往基层兽医实验室过程中未全程使用冷链运输或冷链运输达不到试剂盒要求，造成试剂盒质量下降。基层兽医实验室在试剂盒使用过程中，试剂盒从冰箱拿出来后立即使用，由于试剂盒内冷藏试剂未恢复至室温，温度达不到需求，造成试剂盒使用效果下降。在试剂盒使用后未及时放回冰箱，造成试剂盒内冷藏试剂的质量下降，影响试剂盒下次使用。

2.3 加样器使用不正确

加样器在吸取液体时速度过快，使枪头内具有气泡，导致加样量不足，影响检测结果。加样器在打出液体时速度过，使枪头内液体外溅，导致酶标孔内加样量减少，影响检测结果。向酶标孔中加入液体时枪头刮擦酶标孔内壁或枪头插入太深而接触酶标孔底部，影响酶标孔的吸附功能，增加检测结果的假阳性率或假阴性率。加样器在吸取不同液体时未及时更换枪头，造成交叉污染，影响检测结果。

2.4 孵育方法不当

孵育时温度达不到要求，温度过高或过低直接影响抗原抗体发生免疫学反应的效果。孵育时酶标板没有利用封板膜密封，致使在孵育过程中酶标孔内液体逐步蒸发，影响检测结果，且干燥后的抗原抗体附着于酶标孔内壁，很难清洗掉，致使底物显色后颜色过深。大批量样品检测时一般将多块酶标板叠放孵育，叠放过多造成中间的酶标板孵育温度不够，而多块酶标板叠放可使ELISA 反应出现边缘效应，造成假阳性或假阴性的检测结果。

2.5 洗板方法不当

洗板时加入洗涤液过多，孔与孔之间的液体溢出，造成相互交叉污染。洗板时加入洗涤液过少，洗涤不彻底，造成假阳性或假阴性结果。洗板机的洗板针发生堵塞或吸液不畅，抽吸不完全造成洗板不彻底。大批量样品检测时酶标板过多，出现排队洗板且等待时间较长，造成洗板不彻底。

2.6 显色方法不当

当有A、B 两种液体为底物显色夜时，显色液配制时间过早造成显色效果下降。加入显色剂时有液体溅出孔外造成跳孔，发生污染。大批量样品检测时由于酶标板过多，部分酶标板可能出现显色时间过长，影响检测结果。

3 解决方法探讨

3.1 合理采集和处理样品

血清样品采集过程中应避免出现溶血，对于已经出现溶血的样品应舍弃，重新采集。血清样品处理过程中应避免污染细菌和反复冻融，已经污染细菌的血清样品可通过离心方法去除细菌，对于菌体已经破裂的样品应舍弃，不予检测。冻融后的血清样品应缓慢混合均匀，避免强烈振荡。

3.2 合理选择和使用试剂盒

在试剂盒采购时，应选择具有批准文号的正规生产厂家生产的试剂盒，避免试剂盒滥用。在试剂盒运输和保存过程中应保证全程冷链，避免试剂盒质量下降。在试剂盒使用前应将试剂恢复至室温后使用，避免试剂温度对检测结果造成影响。在试剂盒使用后，应将试剂盒及时放回冰箱，避免试剂盒质量下降。

3.3 正确使用加样器

加样器在吸取和打出液体时应避免速度过快，做到稳吸取和稳打出。加样器在向酶标孔中加入液体时避免枪头触及酶标孔内壁或底部，加样器在吸取不同液体时应及时更换枪头。

3.4 掌握正确孵育方法

开始孵育前应提前开启温箱，并利用温度计准确测定温箱内温度，避免温度过高或过低。孵育前应将酶标板利用封板膜进行密封。大批量样品检测时尽量避免将多块酶标板叠放孵育，如实验条件实在有限，必须叠放时应超过3 块。

3.5 掌握正确洗板方法

洗板前应调节洗涤液至合适体积，避免洗涤液过多或过少。洗板前应彻底检查洗板机，保证洗板机的每个针孔均通畅无阻。大批量样品检测时应控制检测样品数量，每次试验最好酶标板控制在20 块板以内，不要太多。

3.6 掌握正确显色方法

显色夜应现配现用，严禁使用长时间配制后的显色夜，每次使用后剩余的显色液应及时舍弃。加入显色剂时应缓慢加入，避免液体溅出孔外造成污染。显色时间对显色效果至关重要，大批量样品检测时应尽量争取同一时间显色，显色时间越统一，检测结果的误差越小。

4 结语

总之，基层兽医实验室在应用ELISA 方法进行检测时，应加强对ELISA 方法基本原理的理解和掌握，合理采集和处理样品，合理选择和使用试剂盒，掌握正确的加样方法、孵育方法、洗板方法和显色方法，降低各种影响因素对检测结果的影响，注重试验操作细节，认真学习和不断总结经验，提升检测水平，保证检测结果准确无误，不断为动物疫病的防控保驾护航。