苦心丸对心肌缺血模型大鼠Glut4、AKT蛋白表达的影响

李驰坤，欧喜燕，张永和，陈声武，李晓兵

（长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130000）

1 实验材料

1.1 实验动物

选用由吉林大学基础医学院提供的清洁级Wistar大鼠，雌、雄大鼠比例为1：1，体重250～280 g。

1.2 实验药品与试剂

（1）苦心丸（长春中医药大学研发中心生产，0.3 g/粒，含生药8.3 g，批号20100201）；（2）复方丹参滴（天津天士力制药股份有限公司生产，27 mg/粒，国药准字Z10950111，批号100309）；（3）试剂：乌来糖，分析纯，500 g/瓶，批号T20100310，国药集团化学试剂有限公司生产，批号30191228；注射用青霉素钠，规格：160万单位/瓶，国药准字H13020655，生产批号：E1005503，华北制药股份有限公司生产。大鼠葡萄糖转运蛋白4（Glut4）试剂盒，规格：96T，上海科敏生物科技有限公司生产，批号20120602；大鼠磷酸化AKT蛋白（AKT）ELISA试剂盒，96T，上海科敏生物科技有限公司生产，批号20120602。

1.3 实验主要仪器

酶标仪：BIO680，美国伯乐公司产品；台式高速冷冻离心机：型号：Biofuge stratos，德国SORVALL产品；热恒温鼓风干燥箱，型号：DHG-9003BS-Ⅲ型，上海新苗医疗器械制造有限公司产品。

2 实验方法与结果

2.1 实验方法

2.1.1 实验分组

按随机方式将实验大鼠分成6组，即假手术组、模型组、阳性对照组（复方丹参滴丸）、苦心丸高、中、低剂量各1组，每组中均包含5只雌大鼠、5只雄大鼠。

2.1.2 给药途径、方法及剂量

实验大鼠均通过灌胃方式给药，剂量如下：苦心丸高、中、低剂量组分别为1.48 g/kg、0.74 g/kg、0.37 g/kg体重；阳性对照药组用药为复方丹参滴丸，剂量为250 mg/kg体重。以上各组给药均为1次/d，共连续7 d，第7 d给药后30 min进行心肌缺血模型的复制。

2.1.3 大鼠心肌缺血模型复制方法

按照文献中描述的结扎左冠状动脉前降支法进行适当改进再进行心肌缺血模型的复制。

首先使用乙醚将实验大鼠麻醉，选定胸正中为手术区域，去毛备皮消毒，做好关闭胸腔的荷包缝合准备，之后沿锁骨正中线做2 cm纵向切口切开皮肤，在第四或第五肋间将大鼠胸部肌肉进行钝性分离，使胸骨、肋骨充分暴露，将胸腔打开，心包剪开，在胸廓轻轻按压以将大鼠心脏挤出。使用无创性缝合线在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处进行冠状动脉的结扎，之后将心脏迅速放回原位，将胸腔气体挤出，并迅速将缝合线拉紧，将胸腔逐层进行关闭，将外皮缝合好，保证开胸时间＜60 s。

对于假手术组大鼠，无创性缝合线穿过左冠状动脉，但不结扎，其余操作方法同上。

造模成功：结扎部位下的心肌颜色发白，心肌搏动明显减弱，心电图ST段弓背抬高幅度明显。

2.1.4 指标检测

从造模成功的大数中选取雌鼠、雄鼠各24只，每组包括雌鼠、雄鼠各4只。造模成功24 h后向大鼠腹腔注射20%乌来糖注射液进行麻醉，剂量为1 ml/100 g。使用无菌注射器在大鼠腹主动脉末端采集5 mL血液标本，在4℃以下条件下进行离心，转速为3000 r/min，时间为10 min，之后取上清液，在-80℃条件下进行保存。

2.1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以“x±s”表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.2 实验结果

苦心丸对心肌缺血模型大鼠心肌糖代谢基因Akt、GLUt4蛋白水平表达的影响。检测结果显示，与模型组比较，苦心丸中剂量组和低剂量组动物血清AKT蛋白含量高于模型组，苦心丸高、中、低剂量组动物GLUt4蛋白水平均高于模型组。见表1。结果表明苦心丸可以促进心肌缺血动物模型Akt和GLUt4蛋白的表达。对于抑制损伤心肌细胞凋亡和对缺血心肌损伤有一定的保护作用。

表1 苦心丸对心肌缺血模型大鼠Akt、GLUt4蛋白水平表达的影响（x±s）

3 讨 论

要想保持心脏功能正常运行，需要足够的氧及氧化产物产生腺苷三磷酸（ATP），其中又以长链脂肪酸作为主要供能来源。在心肌缺血缺氧的情况下，直接影响到心肌代谢功能，葡萄糖代谢则在心肌供能中扮演重要角色，葡萄糖从细胞外进入细胞需要糖转运蛋白协助运输，糖转运蛋白是细胞转运葡萄糖的载体，Akt和Glut4在糖代谢活动信号转导途径中起重要调节作用。

GLUt4主要分布在细胞内，通常不参与葡萄糖的转运，但是心肌缺血缺氧情况下，受到胰岛素刺激作用，可以使GLUt4到细胞膜上帮助葡萄糖转运，而GLUt4的易位又与Akt/PKB信号转导途径相关联。Akt的生物作用很多，例如促进蛋白合成、减少细胞凋亡、增强心肌收缩功能等。研究发现，稳定的野型PKB过度表达大鼠能够提高Glut4水平，促进葡萄糖转运功能，Akt活化能够有效保护缺血心肌。心肌缺血缺氧，收缩功能降低时，磷酸化Akt和Glut4表达的增强幅度显著，提示缺血后心肌的Akt和Glut4对于糖代谢有调节作用。因此缺血心肌糖代谢基因Akt、GLUt4 的蛋白水平表达研究对于阐明苦心丸中抗心肌缺血有效成分的作用机理有重要意义。