葡萄酒中农药残留检测的前处理方法研究进展

郭亚芸，史红梅，韩晓梅，于清琴*

（山东省葡萄研究院/山东省葡萄栽培与精深加工工程技术研究中心/农业农村部华东都市农业重点实验室，山东济南 250100）

随着生活水平的提高，人们越来越注意饮食的健康问题。饮酒爱好也逐渐由高度酒向低度酒转变，粮食酒向果酒转变。由于葡萄酒中含有天然的抗氧化剂，适量饮用有益于人体健康，因此，葡萄酒成为世界上最受欢迎的含酒精饮料之一。

葡萄酒是由新鲜葡萄或葡萄汁经过发酵产生的含酒精饮料。在葡萄生长期间，为了提高产量和品质，或多或少会应用农药[1]，一些农药施用后不易分解，尤其是采摘前喷施的农药，会不同程度的残留在果实上，然后通过发酵进入葡萄酒中[2]。虽然葡萄酒属于农业深加工产品，它的整个生产过程涉及许多不同的复杂技术，尤其是酒精发酵过程，可以减少农药的残留量，但仍有一部分农药残留在葡萄酒中[3]。比如葡萄生长中经常喷施的嘧霉胺和嘧菌酯等杀菌剂，在葡萄酒酿造过程中的物理、化学和生物反应中不易分解，导致在葡萄酒样品中可检测到大量杀菌剂残留[4]。甚至还有一些农药如乐果、敌百虫、甲霜灵等，经过发酵过程后可以转化成毒性更强、对人体及环境危害更大的化学物质[5]。人体若是长期进食含有农药的葡萄酒后，就会在体内积累，引起慢性中毒，因此，人们对葡萄酒的安全性要求在不断提高，葡萄酒中农药残留量的检测就显得尤为重要。

目前，国内外葡萄酒中农药残留检测方法一般包括样品前处理和仪器分析两部分。由于葡萄酒中农药残留量低，且葡萄酒基体复杂，若不进行有效的样品前处理，会对后续的仪器分析结果产生影响，因此，样品前处理技术的好坏成为制约农药残留检测是否成功的关键。本文对葡萄酒农药残留检测方法的样品前处理技术进行综述，旨在为葡萄酒农药残留检测技术的进一步研究和发展提供理论基础和技术参考，保证葡萄酒中的农药残留限制在安全范围，提高消费者食品安全意识[2,6]。

1 葡萄酒中农药残留检测常见前处理方法

1.1 液液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）

液液萃取作为一种前处理方法，其萃取过程无需特殊装置和材料。但是，液液萃取试验操作繁琐、费时，并且试验中使用大量有机溶剂，对人体和环境危害较大，因此，此方法在农药残留检测中的应用越来越少。王春利等[6]采用体积比为1：1的正己烷和乙酸乙酯的混合溶液作为萃取剂，通过气相色谱-质谱联用进行检测，建立了液液萃取-气相色谱-质谱快速检测葡萄酒中14种农药残留的方法。

1.2 固相萃取法（solid phase extraction，SPE）

固相萃取技术是上世纪80年代中期发展起来的一项样品前处理技术，主要用于复杂样品的分离、富集和净化，旨在降低样品基质干扰，提高检测灵敏度，同时也达到了保护分析仪器的效果。与传统的液液萃取法相比，固相萃取技术可以提高分析物的回收率。吴凤琪等[7]的试验中采用二氯甲烷作为葡萄酒样中农药残留的提取溶剂，然后经固相萃取柱净化，气相色谱-质谱/质谱仪检测，建立了固相萃取-气相色谱串联质谱法分析葡萄酒中常见75种禁限用农药残留量的方法，该方法准确度高、精密度好，在选择反应监测离子的模式下对葡萄酒中75种农药残留进行了质谱定性和内标法定量。赵建晖等[8]采用乙腈提取葡萄酒样中农药残留，CARB/PSA双层固相萃取小柱净化，建立固相萃取-液相色谱串联质谱分析葡萄酒中常见27种禁限用农药残留的方法。蒋宏等[9]采用C18固相萃取小柱对葡萄酒中17种常见禁限用农药残留进行富集、净化，与气相色谱/负化学离子源质谱联用，建立17种残留农药的检测方法。李晓燕等[10]采用Pesti Carb-NH2固相萃取柱对葡萄酒中有机氯农药六六六4种同分异构体残留进行富集、净化，并与气相色谱联用，建立葡萄酒中农药六六六4种同分异构体残留量的检测方法，用该方法对市售的4种国产葡萄酒中α-六六六、β-六六六、γ-六六六和δ-六六六进行检测，结果显示，4个葡萄酒样均检出有机氯农药六六六的4种同分异构体。庄丽丽等[11]采用HLB小柱和LC-NH2小柱对葡萄酒中有机磷农药残留进行富集、净化，与气相色谱火焰光度技术联用，建立葡萄酒中有机磷农药残留的检测方法，并用该方法对2款白葡萄酒和5款红葡萄酒中的16种有机磷农药进行检测，甲基硫环磷在1款红葡萄酒中检出，甲基对硫磷在2款红葡萄酒和1款白葡萄酒中检出，地虫硫磷在1款红葡萄酒中检出，浓度均小于0.01 mg/kg。由于固相萃取试验过程中使用大量有机溶剂，对人体和环境危害较大，且固相萃取小柱成本较高，因此，新型的绿色环保前处理技术越来越多被人们关注。

1.3 固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME）

固相微萃取法是在固相萃取法的基础上建立起来的一种集富集、净化、进样于一体的绿色环保型前处理方法。此方法不使用有机溶剂，有3种萃取形式，即浸入式萃取、顶空萃取和膜保护萃取形式。早在1998年，Matteo等[12]就已经采用商品化的100 µm聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取头，以浸入式固相微萃取方式与气相色谱质谱联用，建立了葡萄酒中农药残留的检测方法，并运用此方法对21款葡萄酒（10款白葡萄酒和11款红葡萄酒）中的14种农药残留进行了检测。结果显示，在6款白葡萄酒和6款红葡萄酒种共发现了7种农药，浓度是0.8～5 µg/L，其中，83%的含农药葡萄酒样品中存在农药腐霉利。此外，Ertan等[13]采用商品化65 µm PDMS/DVB萃取头，建立了固相微萃取与气相色谱质谱联用检测葡萄酒中毒死蜱和甲基毒死蜱的方法，此方法的加标回收率和重现性较好。应用此方法，对土耳其3个产区的葡萄酒进行检测，毒死蜱和甲基毒死蜱残留量远低于欧盟的最大限量。崔宗岩等[14]通过考察富集的目标农药的种类和数量，选择了商品化85 µm PA萃取头，建立了浸入式固相微萃取与气相色谱质谱联用检测葡萄酒中农药残留的方法，此方法可以准确筛查检测94种农药残留，运用此方法，对市场上的327个葡萄酒样品进行检测，结果显示，在232个葡萄酒样品中存在至少1种农药残留。郭亚芸等[15]采用商品化的85 µm PA萃取头，以浸入式固相微萃取为前处理方法，气相色谱-质谱为检测手段，建立了葡萄酒中三唑类杀菌剂残留的检测方法，该方法有较高的准确度和良好的稳定性，可用于葡萄酒中戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲环唑的残留检测。Manuela等[16]采用商品化的100 µm PDMS萃取头，建立了固相微萃取与气相色谱联用检测葡萄酒中农药残留的方法，运用此方法，对葡萄牙南部的10款白葡萄酒和15款红葡萄酒进行检测。胡媛等[17]采用溶胶-凝胶包埋技术，自主研发了耐高温涂层聚二甲基硅氧烷，涂覆于石英纤维表面作为萃取头，用该萃取头进行固相微萃取试验，与气相色谱仪（配备热离子化检测器）联用，建立了测定红葡萄酒中有机磷农药残留的方法，并运用此方法对红葡萄酒中久效磷、乐果等12种有机磷农药残留进行了测定，结果显示红葡萄酒中存在乐果残留，浓度为0.05 mg/L。Pang等[18]采用溶胶-凝胶技术，自主研发了离子凝胶基离子液体([C16MIM][NTf2])，涂覆于石英纤维表面作为萃取头，该萃取头具有萃取能力强和使用寿命长等优点，以此萃取头进行顶空固相微萃取试验，与气相色谱仪（配备火焰光度检测器）联用，建立了固相微萃取与气相色谱联用检测葡萄酒中有机磷农药残留的方法，该方法的检出限和方法的定量限明显低于其他现有方法，并运用此方法对2款红葡萄酒和1款白葡萄酒中甲拌磷、对硫磷、甲基对硫磷和马拉硫磷4种有机磷农药进行了添加回收试验，效果良好。由于商品化的萃取头价格昂贵，葡萄酒中的天然色素，尤其是红葡萄酒中的天然色素容易污染萃取头，导致萃取头寿命缩短，检验成本提高，因此，科研工作者的兴趣逐渐从购买商品化萃取头向自主研发萃取头方向上转变，固相萃取头的研发成为今后研究的热点和难点。

1.4 基质固相分散萃取法（matrix solid phase dispersion, MSPD）

基质固相分散萃取是1989年Barker等[19]发明的一种新型样品前处理技术。朱学良等[20]采用Florisil硅土作为吸附剂，建立了基质固相分散与气相色谱（配电子捕获检测器）联用检测葡萄酒中五氯苯、β-六六六、五氯苯胺、甲基五氯苯基硫醚、腐霉利等5种农药残留的方法，并对空白酒样进行了添加回收试验，效果良好。Zhu等[21]采用乙腈萃取，Florisil硅土作为吸附剂，建立了固相分散萃取与气相色谱联用（配电子捕获检测器）测定葡萄酒中腐霉利等3种农药残留量的方法，应用此方法，对市售的不同品牌红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒进行检测，未发现农药残留。MSPD法填补了溶液提取固体和半固体样品的空白，试验过程中无需进行组织匀浆、沉淀、离心、pH调节和样品转移等操作步骤，操作简单，避免了样品损失，减小了试验误差，此外，该方法还具有分析速度快、有毒有害溶剂用量少等优点。缺点是目前没有实现自动化，试验操作需手动，因此，自动化研究成为今后研究的热点和难点[22]。

1.5 分散固相萃取法（disperse solid phase extraction, dSPE）

分散固相萃取又称QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）萃取，是2003年由美国农业部Anastassiades等开发出来的一种快速的农产品检测样品前处理技术。陈楠楠等[23]采用乙腈萃取，PSA/GCB/ODS作为吸附剂，建立了分散固相萃取GC-MS法快速测定葡萄酒中22种农药残留的方法，采用本方法对不同产地葡萄酒样品进行检测，其中1个葡萄酒样品被检出甲霜灵残留，残留量为0.08 mg/kg。谢建军等[24]采用乙腈快速提取，GCB、NH2和PSA作为吸附剂，建立了固相分散萃取与气相色谱质谱联用测定葡萄酒中43种农药残留量的方法，应用此方法，对20个来自不同国家和国内不同地区的葡萄酒样进行检测，结果在9个葡萄酒样中发现农药残留。吴凤琪等[25]采用乙腈提取，PSA、C18和GCB作为吸附剂，建立了分散固相萃取-气相色谱-串联质谱检测葡萄酒中嘧霉胺、腐霉利等56种农药残留的方法，并对空白酒样进行了添加回收试验，效果良好。利用酸化乙腈提取，N-丙基乙二胺、石墨化碳黑和C18粉末作为吸附剂，建立了基质固相分散萃取与气相色谱质谱联用同时测定葡萄酒中16种有机磷类和有机氯类农药残留的方法[26]。按试验方法对红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒样品进行了检测，结果显示，白葡萄酒、桃红葡萄酒和红葡萄酒中各发现了8种农药残留。分散固相萃取法具有操作简单、耗时短、回收率高等优点，但对于茶叶、高脂产品等具有复杂基质的样品仍有一定局限性[22]。分散固相萃取试验中，吸附剂的选择尤为重要，近年来，科研工作者的研究方向逐渐向新型吸附剂材料的研发上发展。

1.6 分散液液微萃取法（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）

分散液液微萃取技术是2006年Rezaee等[27]提出的一种新型的液相微萃取技术，它具有操作简单、有毒有害溶剂用量少和富集倍数高等优点。Chen等[28]以氯仿为萃取剂，乙腈为分散剂，建立了分散液液微萃取与气相色谱质谱联用检测葡萄酒中27种常见禁限用农药残留的方法。运用该方法对10款进口葡萄酒（5款红葡萄酒、5款白葡萄酒）进行检测，其中9款葡萄酒中检出甲霜灵、腈菌唑等5种农药，而甲霜灵浓度最高，达18.6 µg/L。郭亚芸等[29]以十一醇为萃取剂，超声辅助萃取，建立了分散液液微萃取与气相色谱/质谱联用检测葡萄酒中三唑类农药残留的分析方法，运用该方法对市售的5款葡萄酒中戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲环唑的残留量进行了测定。Chu等[30]以正辛醇为萃取剂，上下振动辅助，建立了分散液液微萃取与气相色谱质谱联用检测葡萄酒中杀菌剂残留的方法。运用此方法对1款红葡萄酒和1款白葡萄酒中嘧菌环胺、腐霉利等6种杀菌剂进行检测，结果显示，红、白葡萄酒均未被污染。添加回收试验，效果良好。Rodríguez-Cabo等[31]以十一醇为萃取剂，建立了分散液液微萃取与气相色谱质谱联用检测葡萄酒中杀菌剂残留的方法，以西班牙西北部超市购买的5款红葡萄酒和7款白葡萄酒为样品，评估了该方法测定真实葡萄酒中杀菌剂的有效性，效果良好。Wang等[32]以离子液体（HMIMPF6）为萃取剂，超声辅助，建立了分散液液微萃取与高效液相色谱联用测定红葡萄酒中杀菌剂残留的方法，以丰收和长城两个品牌的红葡萄酒为试样，验证该方法的适用性。结果表明，两个品牌的红葡萄酒均未受到嘧霉胺等7种杀菌剂污染。Timofeeva等[33]将二氯甲烷和己醇的混合物添加到葡萄酒样中，葡萄糖作为引发剂，加热后二氯甲烷挥发，己醇浮于样品顶部，分离后进样检测，建立了分散液液微萃取与液相色谱质谱联用检测葡萄酒中杀虫剂残留的方法，并用此方法检测了3款白葡萄酒和1款红葡萄酒中马拉硫磷、二嗪农和伏杀磷的残留量。结果显示，在1个白葡萄酒样品中发现了二嗪农残留。分散液液微萃取试验中有毒有害的分散剂正逐步被表面活性剂或超声等辅助形式所取代，萃取剂的选择也尤为重要，传统的萃取剂（有机溶剂）具有毒性大，且不适用于复杂基质的样品等特点，因此，适用于复杂基质的绿色环保型萃取剂的合成成为今后研究的热点和难点。

2 葡萄酒中有机磷农药残留检测前处理方法

有机磷农药是我国现阶段使用量最大的农药，品种和用量居各类农药之首[34]。葡萄酒中有机磷农药残留检测前处理方法主要有：液液萃取法[35]、固相萃取法[27]、固相微萃取法[28,31]、基质固相分散萃取法[36]。液液萃取法、固相萃取法和基质固相分散萃取法试验过程中需采用易挥发的有毒有机溶剂，对人体和环境存在威胁。固相微萃取法不使用有机溶剂，是集富集、净化、进样于一体的绿色环保型前处理方法，但是，试验中萃取头价格昂贵，易损坏。因此，适用于葡萄酒，尤其是红葡萄酒基质的绿色环保型前处理方法的研究成为今后研究的热点和难点。

3 结论

样品前处理技术是葡萄酒农药残留检测试验过程的关键，本文对国内外葡萄酒中农药残留检测方法中的前处理方法进行了综述，主要包括液液萃取法、固相萃取法、固相微萃取法、基质固相分散萃取法、分散固相萃取法和分散液液微萃取法，并对各方法的优缺点及应用前景进行了阐述。实现前处理过程的自动化，提高工作效率，减少试验过程中有毒有害溶剂的使用，降低检验成本，是目前葡萄酒农药残留检测试验中亟待解决的问题。