急性心肌梗死通过氧化应激及NF-kb途径加重造影剂肾损害机制研究

陶志文

（南京医科大学第一附属医院心内科 江苏 南京 210029）

造影剂肾病是院内获得性肾功能不全的第三位因素，其定义为应用造影剂后48～72小时肌酐升高较基线水平大于25%或者绝对值增加0.5mg/dL(44.2µmol/L)。有研究调查表明在广泛应用造影剂的人群中，造影剂肾病的发生率在约2%。然而在高危人群中造影剂肾病的发生率约在20%～30%［1-5］。已有充分数据表明急性心肌梗死PCI导致的造影剂肾病的发生率显著高于择期PCI手术患者［6-7］。既往有研究揭示了造影肾病的发生是由于急性肾损伤，根据以往研究和调查，造影剂肾病的发生机制包括了以下方面，（1）肾循环改变导致的缺血缺氧，（2）造影剂的直接肾毒性和氧化应激，（3）急性心肌梗死这种特殊病理生理状态[8-11]。目前急性心肌梗死状态造影剂对肾脏的损害的病理过程仍不清楚。因此，本研究的目的是进一步明确造影剂肾病在急性心肌梗死状态发生率升高的机制。

1.研究方法

1.1 心肌梗死模型建立和实验分组

大鼠过夜禁水大约12小时，通过结扎大鼠前降支构建心肌梗死模型，并最后行心脏超声检查确定心肌梗死模型建立成功。未结扎前降支的大鼠分为对照组control（n=8）和造影剂组CM（n=12）,结扎前降支的大鼠，分为心肌梗死组AMI（n=8），心肌梗死+造影剂AMI+CM(n=12)。CM组和AMI+CM 组注射造影剂，剂量为2g 碘/kg，Control组和AMI组注射等剂量生理盐水。

1.2 血流动力学监测

各组术后45min，大鼠行心脏超声检查，检查心脏室壁运动功能及左室射血分数，CM组和AMI+CM组在基线水平检测各组右侧肾动脉血流速度，然后分别注射造影剂记录各组在0min,2min,8min,15min,4h,24h的肾血流速度的数值（VRABF）。

1.3 造影剂滞留观察

在CM组和AMI+CM组，随机取四只进行肾CT扫描，记录注射造影剂前基线水平，注射造影剂后4h和12h，观察造影剂在肾脏内存留情况，并计算肾皮质的CT扫描得出的对比度值。

1.4 血清学指标检测

在各组处死后行下腔静脉抽血，然后分别测各个指标。血肌酐采取 Jaffe反应比色法测定。血清ET-1和Ang-Ⅱ采取按照试剂厂商说明书进行检测。

1.5 肾脏组织活性氧族检测

各组处死后取右侧肾脏，按照杰美公司的试剂盒说明进行操作。即刻放进荧光酶标仪检测：激发波长490nm，散发波长520nm。最终得出各组的荧光读数，最后以control组作为基线对照。每组肾脏组织各取100mg，进行提取RNA，方法如下：匀浆处理：将组织在液氮中磨碎,每100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。然后进行cDNA的合成，引物设计通过Primer 5软件设计引物 NF-ΚB p53mRNA为 5-CCAAAGACCCACCTCACC-3(forward)and 5-CGCATTCAAGTCATAGTCCC-3(reverse),Caspase-3的引物为5-GCTGAGTATGTCGTGGAG-3(forward) 和5-TCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3(reverse).GAPDH 的引物为 was 5- CTGGACTGCGGTATTGAG-3(forward)and5- GGGTGCGGTAGAGTAAGC-3(reverse)。逆转录合成通过反转录试剂盒操作，应用反转录PCR仪合成cDNA，然后在通过Real-time PCR 扩增，扩增结束后，得到每孔的CT，最后通过GAPDH作为内参，先每组都减去GAPDH CT，然后在减去所有组中的最大值及计算应用2-∆∆Ct。

1.6 统计学处理

采用SPSS进行t检验和单因素方差分析比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 肾功能、内皮素、血管紧张素、肾脏ROS表达水平在各组的变化

内皮素在4h节点CMI、CMI+AMI、AMI均有显著升高，并且CM、CM+AMI在24h仍然显著高于对照组(P＜0.05)。AMI+CM组的4h内皮素表达显著高于CM组（P＜0.05)。(Fig1A) 血管紧张素在4h节点CMI、CMI+AMI、AMI均有显著升高。AMI+CM血管紧张素在4h表达最高（P＜0.05）。随后AMI+CM组血管紧张素表达在24h已下降。(Fig 1B)肌酐在4h时所有组均无显著改变(P＞0.05)。除了对照组，其他组在24h时肌酐均显著升高，其中AMI+CM组是肌酐升高最显著的（P＜0.05），CM组肌酐水平和AMI组比较无显著差异。(Fig 1C)与对照组比较，AMI、AMI+CM、CM组在4h时ROS表达显著增高，并且持续升高至24h。AMI+CM组的ROS表达水平在24h显著高于其他组(P＜0.05)。(Fig 1D)

2.2 肾动脉血流速度在各组的变化

AMI+CM组的肾动脉血流速度从0min～24小时均显著低CM组(P＜0.05)。在刚开始注射造影剂的2min内，肾动脉血流速度在CM组从1042.7±92.6mm/s 增加至1290±107.80 mm/s。AMI+CM组从792.80±36.19 mm/s 增加至 1043.39±75.58 mm/s。随后肾动脉血流速度下降至基线水平至24h(Fig 2A)。在注射造影剂前，通过超声心动图评估各组的的室壁运动障碍。可以发现建立心肌梗死模型的大鼠的室壁运动显著减弱，心脏超声检测LVEF，AMI+CM组和AMI组的LVEF显著下降，和CM组和对照组比较显著差异（P＜0.05），AMI和AMI+CM之间无显著差异，CM和对照组无显著差异（P＞0.05）。(Fig 2B 2C)

2.3 造影剂在肾脏滞留各组比较

总体上造影剂注射后各组均有一定程度的造影剂的滞留。在CM组和AMI+CM组造影剂注射4h后，我们观察到肾皮质CT分别为124.85±15.37 and 65.06±7.13 HU，(两组基线值分别为 46.48±2.9HU and 45.36±2.68 HU)。在造影剂注射12h后，AMI+CM和CM组的CT和基线比较无显著差异。(FIG.3)

2.4 NF-κb and caspase-3 mRNA在各组表达情况

NF-kb因子表达升高与肾脏损伤有密切关联，故我们通过real-time PCR方法检测各组肾脏中NF-kb表达情况.结果显示与对照组相比，其余各组NF-kb.的表达均有显著升高，4h时CM组，CM+AMI组基因表达显著高于control组，并且仍然在24h持续。AMI组在24h也有所升高，但显著低于CM+AMI组的表达（P＜0.05），CM+AMI组表达在24h也显著高于CM组（P＜0.05）。(Fig4A)Caspase-3基因与凋亡和肾脏损害有一定关系。Caspase-3基因表达与control组相比，CM组，AMI+CM组和AMI组在4h也显著升高。CM组和CM+AMI组仍然继续升高至24h，而AMI组在24h则下降。在CM+AMI组，该基因的表达在4h和24h显著显高于CM组(P＜0.05)。(Fig 4B).

3.讨论

本研究表明在急性心肌梗死状态下，造影剂对肾脏的损害要比正常状态下的大鼠更加严重。主要为心梗导致的血流动力学变化，以及造影剂和心梗带来的氧化应激，从而引起的凋亡和氧化应激相关基因水平的改变。

（1）血流动力学改变。造影剂可以引起肾动脉及肾内血流动力学改变已经被很多动物实验和临床实验所证实，这主要表现在肾皮质和髓质的血流下降[12-13]，和增加的肾内血管的阻力。我们通过结扎前降支建立心肌梗死模型，并且是引起急性症状和血流动力学改变较大的常见血管，所有大鼠在注射造影剂前检测VRABF，开始进行造影剂注射，结果表明造影剂对肾动脉的影响在CM和CM+AMI组两者是无显著影响的，所以我们认为心肌梗死引起了肾动脉的血流下降，进一步引起了肾内灌注不足，从本研究中发现ET-1在AMI+CM组一直都是处于最高，从4h开始到24h仍然继续升高。Ang-Ⅱ也是缩血管物质，但主要作用于较大血管及动脉血管，本实验中Ang-Ⅱ在AMI+CM组升高最显著，也有文献报道正常大鼠在注射造影剂后Ang-Ⅱ会有所升高[11，14]。通过CT扫描观察造影剂在AMI+CM组和CM组肾脏的滞留，结果说明造影剂在AMI+CM组滞留的时间更长，这也与肾血流的下降和缩血管物质的增多引起的微循环功能的障碍相互吻合。

（2）氧化应激，NF-κb和CASPASE-3 基因升高。以往很多研究表明造影剂引起的肾脏损害，特别是肾小管的凋亡和氧化应激密切相关，在一些大规模的临床试验中，抗氧化剂NAC被证明可以减少临床造影剂肾病的发生[15]，本试验中同样发现ROS产生最多的也是AMI+CM组，而AMI组高于control组说明心肌梗死时本身就造成了肾脏ROS的增多，并且和CM组升高无显著差异，可以认为在心肌梗死后在注射造影剂前ROS就已经升高，已经改变了髓质的氧平衡，从而增强了ROS这种途径的损伤作用。ROS在凋亡中扮演了重要角色，许多实验表明ROS和凋亡密切相关，最后激活了Caspase-3[16]。Caspase-3是调节凋亡的最重要一个基因，许多实验都已经证实在注射造影剂后该基因会升高[17-19]，我们实验同样也证实其重要性，实验结果说明了在心肌梗死时Caspase-3肾脏表达升高并且和造影剂造成该基因表达上调相互增强是促进凋亡的一个重要因素。NF-κb是一个重要的核转录因子，有多重效应，有文献报道它与细胞凋亡有相关，可以促进细胞凋亡[20-21]而有研究表明氧化应激可以激活其表达，并且和造影剂对肾脏的损害有相关[22]。本实验中发现了该基因表达的增高，并且在AMI+CM组增高最显著，在AMI组我们也发现了该基因表达增高，同样也说明了在心肌梗死时肾脏的ROS有所升高。在很多指标如ET-1，Ang-Ⅱ，Caspast-3等在AMI组表达和在CM组相似，但这些改变在AMI组只造成了较少的凋亡比例，和轻微的肾脏病理学的改变，这些病理生理改变与CM组相比显著减轻，这些结果表明造影剂对肾小管的损害作用是最主导的作用，心肌梗死状态只是对造影剂作用起到一定强化。