结核分枝杆菌感染人群的免疫干预进展

苏城，卢锦标

结核分枝杆菌感染人群的免疫干预进展

苏城，卢锦标

102629 北京，中国食品药品检定研究院结核病疫苗室

自结核病的病原体——结核分枝杆菌（，Mtb）被 Robert Koch 发现以来，结核病患者的免疫治疗研究就此拉开了帷幕[1]。Koch 当仁不让地成为开展结核病免疫治疗的第一人。他发现，豚鼠初次皮内攻击 Mtb 4 ~ 6 周后，再次皮内注射 Mtb 活菌或结核菌素（旧结核菌素，OT），会使豚鼠的病理性反应有所减轻，表现为注射部位的病灶很快坏死并脱落，而留下的溃疡通常较易愈合[2]。动物实验上的这种好转迹象给了 Koch 启发。然而，当他用结核菌素对结核患者进行免疫治疗时，却产生了意想不到的后果，部分结核病患者的病变加重，出现发烧和休克等症状，甚至注射后几小时内死亡[3]。这种现象（即 Koch 现象）的原因在于，已感染 Mtb 个体再次接触大量结核抗原后，浅表处病灶组织的坏死并不能起到保护作用，反而导致深层病灶大量结核活菌的暴露，使得 T 细胞介导的特异性细胞因子大量表达释放，引起组织损伤，甚至器官衰竭[3]。

随着第一代抗结核药物链霉素和异烟肼的出现，第一代免疫治疗方式由于高风险而很快被抛弃。抗生素优异的治疗效果挽救了无数结核患者的性命，然而，其治疗弊端也如影随行，长期的肝肾毒性导致患者不耐受，依从性低，既降低了疗效，又增加了耐药结核的风险。时至今日，抗结核药物已开发多达三十余种，这种弊端仍无法避免，且由于新化学药物开发的周期越来越长，“新药-耐药-新药”的研究模式也难以为继，并导致了各种耐药结核的出现。因此，在化学药物治疗方式作为当前结核病主要控制手段的同时，免疫治疗又重新进入研究者的视野，期待能成为结核病患者治疗的新方法。同时，由于结核潜伏感染（LTBI）人群约占总人口的 1/4[4]，这部分人群的免疫预防也成为结核病防控的关键。本文针对 Mtb 感染人群（结核病患者和 LTBI）的免疫干预措施进行综述，为国内结核病疫苗研究者提供借鉴。

1 结核病患者的免疫治疗

结核病患者的免疫干预措施一般是在化疗的基础上，增加免疫治疗，以提高结核病的治愈率。抗生素对生长期结核菌的杀灭作用立竿见影。常规的化疗可迅速杀死大量结核菌，但极少部分结核菌转入休眠期后，由于代谢不活跃，化疗效果大打折扣，这也是目前临床上化疗常需要长达半年以上的原因所在。而通过疫苗免疫，激发机体的免疫功能，有望提高机体清除结核菌的能力。目前，先化疗后免疫模式在分枝杆菌菌体灭活疫苗上研究得较为深入，此类疫苗有母牛分枝杆菌疫苗、RUTI、MIP 等。

1.1 母牛分枝杆菌疫苗

最早冠以“母牛分枝杆菌”疫苗研究的是英国伦敦大学学院 John Stanford 教授[5]。20 世纪 90 年代，他主导研发的“母牛分枝杆菌”灭活疫苗在世界范围内多个国家开展了一系列小到中规模的随机、安慰剂对照、部分盲法的临床试验，研究对象包括初治、复治以及耐多药结核病患者，以评价疫苗的免疫治疗效果[5]。这些研究从最初单剂量的不甚理想，到后期转变为多剂量后显示出良好的辅助治疗效果。因此，WHO 在 20 世纪 90 年代初的结核病研究与发展战略规划中，以母牛分枝杆菌（）为例，提出了化疗和免疫治疗相结合的思路[6]。需指出，随着分子生物分型工具的发展，John Stanford 教授发现的“母牛分枝杆菌”（NCTC 11659）被证实为另一种分枝杆菌，之前的分析认为和奥布分枝杆菌（）同源性更高[7]，现新的鉴定结果表明，该菌株应归于一类新的分枝杆菌，并被命名为.[8]。

受 WHO 政策影响，国内 20 世纪 90 年代初开始了母牛分枝杆菌疫苗的研究[9]。1996 – 1998 年，母牛分枝杆菌疫苗先后完成了初、复治和难治菌阳活动性肺结核共 568 例的临床疗效对照观察[10]。从公布的初治肺结核疗效报告看，该临床研究中，共纳入 342 例初治菌阳肺结核患者，随机分为疫苗组和对照组（各 171 例）。疫苗组采用抗结核药物（2HRZE/2HR）联合疫苗治疗 6 个月；对照组仅采用抗结核药物治疗（2HRZE/4HR）。结果显示，母牛分枝杆菌疫苗不良反应少且较轻微，免疫治疗后可加快结核菌阴转、病灶吸收及空洞缩小关闭速度；1 年后随访，疫苗组的细菌学复发率（3.0%）显著低于对照组（5.6%），复发率低。2001 年，国内自主研发的注射用母牛分枝杆菌疫苗（商品名：微卡）获得生产文号，由安徽智飞龙科马生物制药有限公司生产，正式应用于临床结核病化疗的辅助治疗。目前的 Meta 分析表明，微卡联合抗生素治疗安全性好，有利于初治、复治和耐药结核病患者的痰菌转阴，增强化疗效果，提高临床治愈率，但其远期疗效有待进一步研究[11-12]。

1.2 RUTI

RUTI 疫苗是 Mtb H37Rv 在低氧分压、低 pH 以及低营养条件下培养，收获后经破碎和 Triton X-114脱毒，包埋于脂质体中制备而成[13]。在生长压力条件下，Mtb 表达更多的潜伏性抗原，因此 RUTI 疫苗可诱导针对生长期和非生长期 Mtb 多种抗原的特异性免疫应答。在不同动物模型上，RUTI 疫苗诱导的细胞应答呈现出 Th1/Th2/Th3 混合型，同时也可激发多达 13 种结核抗原的 IgG1、IgG2a 和 IgG3 抗体表达，与抗生素化疗联合使用，展现出良好的免疫效果[13]。RUTI 疫苗的临床试验研究主要包括化疗后的辅助治疗。已完成的临床研究显示高剂量 RUTI 的不良反应偏高，且多针次免疫并不能促进疫苗的免疫应答效果[14-15]。目前 RUTI 疫苗正在开展用于 MDR-TB 辅助治疗的临床 IIa 试验（NCT02711735），耐多药结核病患者采用标准化疗方案治疗 12 周或 16 周后，免疫 1 针次 RUTI 疫苗，评价其安全性和免疫原性，并以痰菌载量为指标评价疫苗的免疫效果。该研究预计 2020 年完成。

1.3 MIP

MIP 疫苗为非结核分枝杆菌的灭活产物，早期在印度用于麻风病患者的辅助治疗[16]。2000 年初，一项非随机的临床试验提示 MIP 疫苗联合化疗可提高结核病患者的治愈率[17]。之后印度完成了 MIP 疫苗免疫治疗结核性心包炎的临床 III 期试验，结果显示 MIP 疫苗没有明显疗效[18]。另一项 MIP 疫苗用于复治结核病免疫治疗的随机、双盲、安慰剂对照的多中心临床 III 期试验中，受试者在化疗强化期开始注射 MIP 疫苗，共 6 针次[19]。结果显示，与单纯化疗（安慰剂组）比较，MIP 疫苗没有不良反应，且 MIP 疫苗组的痰培养阴转率均显著高于安慰剂组，表明 MIP 疫苗可能有清除结核杆菌的作用。

2 结核潜伏感染人群的免疫预防

按新的数学建模结果估计[4]，全球约 1/4 人口，即17 亿，为 LTBI。一般情况下，绝大多数 LTBI 可终身保持健康，但其中 5% ~ 10% 作为易感人群，最终会发展成活动性结核病，成为新的感染源。另外，对于如 HIV 感染，接受免疫抑制剂治疗等因素造成的免疫功能低下者，LTBI 转变成活动性 TB 的概率也会大幅度提高。中国作为目前全球结核病负担第二高的国家[20]，对 LTBI 人群提前干预，降低其发病率是控制中国结核病的关键。相对抗生素治疗，疫苗的免疫预防是最具成本效益的卫生干预措施，也是应对耐药结核病传播的最佳手段。现唯一可用的结核疫苗是卡介苗（BCG），预防儿童脑膜炎和播散性结核病的效果显著，但对成人保护效果不充分，也对 LTBI 无效[21]。因此，针对 LTBI 的预防用疫苗一直是国内外结核新疫苗研究的热点。目前已有多个结核新疫苗在临床试验中用于 LTBI 人群的安全性和免疫原性评价。

2.1 重组 AEC/BC02 疫苗

重组结核疫苗 AEC/BC02 由重组 Mtb 蛋白 Ag85b、ESAT6-CFP10 与复合佐剂系统 BC02 构成，是目前国内首个进入临床研究的结核新疫苗。在临床前的动物保护力研究中，通过建立豚鼠潜伏感染模型，评价疫苗的免疫干预效果。多次评价结果显示，与未采用免疫干预的对照组比较，AEC/BC02 疫苗免疫可有效减轻 Mtb 感染豚鼠的肝脾肺脏器病变程度，并降低脾肺脏的活菌载量[22-24]。2018 年4 月，AEC/BC02 疫苗正式开启潜伏感染人群免疫预防的临床 I 期试验（NCT03026972），拟招募 135 例受试者，包括具有 PPD、IGRA 和 EC 不同免疫标识的四类人群，以评价该疫苗的安全性和免疫原性。该研究预计 2019 年完成。

2.2 母牛分枝杆菌疫苗

母牛分枝杆菌疫苗（微卡）除了作为结核病患者的免疫治疗，也用于 LTBI 的免疫预防。2012 年 12月，经国家食品药品监督管理总局批准，微卡作为预防用生物制品获得临床批件，并于 2013 年 10 月正式开展 III 期临床试验（NCT01979900）。该研究为严格意义的双盲、随机、安慰剂对照试验，共纳入 15 ~ 65 岁 LTBI 受试者 10000 名，用于评估微卡免疫预防的有效性和安全性[20]。目前全部研究已于 2018 年完成，但尚未发布详细的临床结果。

2.3 重组 M72/AS01 疫苗

葛兰素史克（GSK）公司筛选出两种免疫原性强的结核抗原 Mtb39 和 Mtb32[25]，重组表达出融合蛋白 M72（Mtb32C-Mtb39-Mtb32N），与 AS01 佐剂系统构成 M72/AS01 结核疫苗。AS01 佐剂是由单磷酰脂 A（MPLA）和皂素 QS-21 构成的脂质体，能形成抗原库，使抗原缓慢释放，并对 Th1 细胞的刺激作用明显强于 Th2 细胞，其中，MPLA 通过 TLR4 激活 Th1 和 Th17 T 细胞，QS-21 则有助于激活 CD8+CTL 细胞，两者联合使用可发挥协同效应，使抗原刺激的特异性免疫反应达到最大效力[26]。临床前研究中，M72/AS01 疫苗在不同动物模型上均表现出良好的保护效果，可降低肺和脾的细菌载量，延缓或防止体重下降和死亡，以及缓解肺部损伤[27-28]。

迄今，GSK 公司已在多个国家完成了 M72/AS01 疫苗的一系列临床试验，显示出 M72/AS01 疫苗在不同目标人群良好的安全性和免疫原性[29-32]。最近发布的 M72/AS01E疫苗在肯尼亚、南非和赞比亚进行的随机、双盲、安慰剂对照的临床 IIb 试验结果令人关注[32]。该研究旨在评价疫苗对 LTBI 成人的安全性和免疫预防效果，入组 3573 例 18 ~ 50 岁 HIV 阴性的 LTBI 成人，其中 1786 例接种 M72/AS01E疫苗，1787 例接种安慰剂，共肌内 2 剂，间隔 1 个月。2.5 年随访时间内，疫苗组 1623 例纳入观察，发病 10 例，安慰剂组 1660 例纳入观察，发病 22 例。最终获得的疫苗保护率为 54%（95%CI，2.9% ~ 78.2%），且无明显的安全问题。该结果是目前结核新疫苗研究多年来的一个重大突破，首次证实免疫干预可降低 Mtb 感染人群发展成活动性结核的风险。同时，考虑 75% 受试者有 BCG 接种史，意即在 BCG 接种后，通过接种其他疫苗，可获得更高的保护效果。不过，尽管该疫苗 54% 的免疫预防效果满足 WHO 对成人用结核新疫苗保护力的要求[33]，但其持久的保护效果如何还需进一步延长随访时间。

3 小结和展望

在疫苗安全性受到大众广泛关注的今天，Mtb 感染人群的免疫干预需要特别注意其安全性，尤其是发生“Koch 现象”的风险。如早期 Koch 用旧结核菌素治疗结核病患者一样，动物模型上也可观察到类似现象。已感染 Mtb 的小鼠注射结核抗原后，相比未注射组，大量炎症因子表达，造成免疫损伤[34-35]。这可能是由于处于活动性结核病进程的机体的免疫应答异常活跃，再接触到结核抗原，类似于旧结核菌素，引发了超敏反应。对结核疫苗，尤其是分枝杆菌菌体类疫苗，其抗原成分复杂，导致“Koch 现象”的风险也可能较高。从上述结核疫苗的临床研究看，研究者常采用化疗和免疫相结合的综合干预措施。通过化疗杀灭大部分生长期结核菌，机体亢奋的免疫应答得到抑制，再免疫疫苗，激发的是温和的免疫应答反应，从而降低免疫损伤的风险。在疫苗安全性得到保证的前提下，疫苗的免疫干预效果是临床研究的另一个评价重点。由于对结核病感染和免疫相关机制的理解并不透彻，目前尚未发现与疫苗保护作用相关的生物学指标，免疫干预效果的评估仍依赖于流行病学调查。如果能发现合适的免疫标志物反映临床评价终点，以缩短试验周期并降低成本，将有利于更多的结核候选疫苗进入临床评价阶段，从而增加临床试验的成功几率。期望随着技术的发展，最终实现对 Mtb 感染人群可实施有效的免疫干预措施，无疑将提高现有的结核病防控效果。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.011

国家自然科学基金面上项目（81572068）

卢锦标，Email：lujinbiao@nifdc.org.cn

2019-05-14