手动提取核酸的注意事项

张鹏

（辽宁省丹东市动物疫病预防控制中心 118002）

1 注意个人防护

在实验过程会使用到裂解液（TRIZOL）、三氯甲烷、异丙醇等化学试剂，大多对人体有害。

2 防止RNA酶的污染

（1）配液室、提取室、扩增室、电泳室所有的器械及防护用品做到专室专用。实验用的手套、口罩、帽子均为一次性，手套在实验过程中要经常更换。

（2）所有玻璃在使用前要在180℃的高温下干烤6h以上。塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗。

（3）配置的溶液应尽可能地用0.1%DEPC，在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂用DEPC处理过的无菌双蒸水配置，然后经0.22μl滤膜过滤除菌。

3 实验过程需要注意事项

（1）采取水泡皮、水泡液、血液（抗凝血）、血清、组织、细胞培养物和口腔分泌物等样品时，取样的器材必须经高压或者干热灭菌。分离后的样品在2～8℃条件下保存不能超过24h，-70℃可长期保存，但不能反复冻融3次。

（2）除裂解液4℃保存外，氯仿、异丙醇、75%乙醇在-20℃预冷。试验需在生物安全柜中进行，每份样本（1.5ml灭菌离心管）中加入600μl裂解液、200μl待测样本，再加入200μl氯仿，用手颠倒混匀。于4℃12000g离心15min。在样品数量较多时，为了避免加样顺序错误，可以使移液头和样品的位置一一对应，还可以使离心管的管盖略偏向一边，加完一份样品之后把管盖拨向另一边。

（3）上清液相转移到对应的离心管时，可把离心管略微倾斜，在移液头接触到上清液面后，缓抬持移液器手的拇指，同时将移液器向下深入，当移液头快接触到中间层时停止，眼睛盯住移液头的尖部，如果发现有白色絮状物进入，拇指轻压将其推出，然后停止吸液，这样可以保证吸取液体中不含DNA和蛋白质，所有样品转移完成后切记颠倒混匀。

（4）每一步离心时要注意固定离心管的方向，通常将离心管开口朝向离心机转轴方向放置，这样产生的核酸会位于离心管底部靠后的一侧，方便后面吸干残液。

（5）在倒去上清倒置于吸水纸时，吸水纸要有一定的厚度，防止液体渗透到试验台上，污染其他样品，也不要在一张纸上放置过多样品，防止不小心碰倒离心管时，样品互相污染。用微量加样器吸干残液时不要碰倒离心管后部有沉淀的一面，每份样品更换吸头。在室温下干燥时间不宜过长，否则会导致RNA不易溶于DEPC水。

（6）实验过程中产生的吸头应直接打入盛有10%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同交由处理医疗废弃物的专业人员处理。工作台及各种实验用品经常用10%次氯酸钠、75%酒精和紫外灯进行消毒。

以上就是在工作中总结的一点小经验，希望对大家平时的工作起到一些帮助作用，不足之处还希望大家指正，让我们为畜牧业的发展保驾护航！