天津市监狱羁押人员中结核病患者临床分离菌株的基因型分析

谢彤 王春花 赵慧 巨韩芳 穆成 王志锐 孙蕊

作者单位：300011 天津市疾病预防控制中心病原生物检测所(谢彤、王志锐)；天津市结核病控制中心结核病参比实验室(王春花、赵慧、巨韩芳、穆成、孙蕊)

全球范围内不同国家结核病流行病学调查中监狱羁押人群的结核病发病率均明显高于普通人群，其中监狱羁押人员中活动性肺结核平均发病率为普通人群的23倍[1]。结核分枝杆菌(MTB)在传播过程中，经过长期进化已经形成多个不同的基因型，全球不同地区流行的MTB的主要基因型并不相同，其中北京基因型MTB是我国流行的主要基因型[2]。北京基因型菌株基因组核转录因子(nuclear transcription factors，NTF)区如果含有插入序列(IS)6110者则为北京基因型现代株，如果NTF区中IS6110缺失则为北京基因型古代株[3]。此外，根据北京基因型MTB在进化过程中会出现某些大片段的差异区域(regions of difference，RD)缺失，根据RD181、RD150和RD142的缺失情况，北京基因型菌株被分为4个不同进化分支[4]。鉴于监狱羁押人员为结核病的高发人群，笔者研究天津监狱羁押结核病患者中北京基因型MTB流行特征，以揭示菌株不同进化分支的传播情况。

材料和方法

1.菌株来源：收集2013年1月至2016年6月从天津市监狱管理局羁押人员不同结核病患者痰标本中分离培养的124株分枝杆菌菌株，所有菌株均经过对硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼生化试验鉴定证实为结核分枝杆菌复合群。实验中所用的H37Rv标准菌株购自中国药品生物制品所。

2.试剂和仪器：PCR扩增所用的Taq酶分别为2×Taq PCR Mastermix(天根生化科技有限公司，北京)和Q5 Hight-Fidelity 2×Master-Mix(NEB公司，北京)；溶菌酶、蛋白酶K、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基磺酸钠(SDS)等MTB基因组提取试剂购自美国Sigma公司。PCR扩增仪为德国Eppendorf公司生产；NanoDrop 2000超微量分光光度计为美国ThermoScientific公司生产。

3.MTB基因组提取：将生长于改良罗氏培养基中的MTB菌落转移至装有磷酸盐缓冲液(PBS)的1.5 ml Eppendorf管中，菌株经80 ℃水浴灭活后加入溶菌酶过夜消化，采用CTAB法提取MTB菌株的基因组DNA[5]。提取后的基因组DNA溶于1×TE缓冲液中，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定基因组含量。

4.基因型鉴定：基因组中RD207与RD105片段缺失是北京基因型MTB有别于其他基因型MTB的分子特征。采用多重PCR试验，根据琼脂糖凝胶电泳中扩增产物片段长度判定菌株基因组中RD207与RD105的缺失情况[5-6]。RD207缺失的MTB菌株PCR扩增产物长度为393 bp；RD207完整的MTB菌株PCR扩增产物长度为570 bp。RD105缺失的MTB菌株PCR扩增产物长度为547 bp；RD105完整的PCR扩增产物长度为330 bp。

5.基因组NTF区域IS6110分析：北京基因型菌株基因组NTF区IS6110插入序列的分析采用Wada等报道的方法[7]。使用MDR6和MDR6r扩增引物，通过PCR试验分析菌株NTF区中是否存在IS6110序列。如果NTF区含有至少1个拷贝的IS6110序列，则为北京基因型现代株，其扩增产物长度为1.5 kb；反之则为北京基因型古代株，其扩增产物长度为302 bp。25 μl PCR反应体系中含有12.5 μl的Master Mix Taq酶，0.4 μmol/L的引物，以及10～50 ng基因组DNA。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

6.MTB北京基因型菌株RD多态性分析：采用Q5 Hight-Fidelity 2×Master-Mix Taq酶建立的多重PCR反应，分析MTB基因组中差异区域RD181、RD150与RD142的缺失情况，根据扩增产物长度判断差异区域在菌株基因组中是否缺失。25 μl PCR反应体系中含有12.5 μl的Q5 Hight-Fidelity 2×Master-Mix Taq酶，0.5 μmol/L的引物，以及10～50 ng基因组DNA。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。不同差异区域扩增引物序列参考Reed等[6]的报道。

结 果

1.基因分型：124株MTB菌株基因组中，同时发生RD105和RD207缺失的MTB有116株(93.5%)，均属于北京基因型；8株(6.5%)为非北京基因型。

2.北京基因型菌株的进化分支：116株北京基因型MTB菌株中有20株(17.2%)基因组NTF区IS6110序列缺失，为北京基因型古代株；96株(82.8%)MTB基因组NTF区存在IS6110序列，为北京基因型现代株。

根据基因组中NTF区IS6110序列的存在情况和差异区域的多态性，北京基因型菌株被分为4个进化分支(表1)。菌株基因组中存在RD181差异区域的RD181(+)菌株被认为是北京基因型最早期的进化分支。在116株菌株中，RD181(+)的菌株为7株(6.0%)，均为NTF区不含IS6110插入序列的北京基因型古代株；RD181(-)的菌株为109株(94.0%)。在RD181(-)的菌株中，基因组NTF区无IS6110插入序列的北京基因型古代株有13株，占全部北京基因型菌株的11.2%；基因组NTF区存在IS6110插入序列的北京基因型现代株有96株，占全部北京基因型菌株的82.8%。96株北京基因型现代菌株中，95株基因组中有完整的RD150序列，占全部北京基因型菌株的81.9%，仅1株为RD150缺失的北京基因型现代株，占全部北京基因型菌株的0.9%。RD142差异序列存在于所有分析的北京基因型菌株基因组中。

讨 论

北京基因型MTB在包括我国在内的东亚地区的流行最为广泛，在临床分离株中占绝对优势，我国的东北、京津冀、河南等北方地区北京基因型MTB占临床分离株的90%以上[8]。北京基因型MTB在俄罗斯、南非、东南亚、欧洲等多个国家和地区也同样广泛流行，是目前在全球传播最广的基因型[9]。本研究发现，北京基因型菌株在天津羁押人群中占临床分离菌株的93.5%，与天津普通人群肺结核患者中北京基因型MTB的构成比相近[10]。

MTB的进化途径主要是通过大片段的缺失、转位及单核苷酸的突变[11]。其中在大片段进化路径中MTB首先发生RD207与RD105缺失进化成为北京基因型；北京基因型MTB在以后的持续进化过程中，不同的菌株按顺序可能出现RD181缺失、IS6110在NTF区的转位插入形成现代株和RD150的缺失，从而形成不同MTB菌株大片段多态性[12-13]。本研究中，北京基因型现代株占全部北京基因型菌株的82.8%，说明天津监狱羁押人群结核病患者感染的菌株以北京基因型现代株为主；在天津地区普通人群中占86.5%[10]。提示天津地区普通人群与监狱羁押人群结核病患者感染的北京基因型菌株均以现代株为主。回顾性流行病调查显示，卡介苗(BCG)接种者中感染北京基因型现代株的结核病患者比例明显高于未接种者，提示北京基因型现代株较该基因型的古代株更容易逃避BCG接种所产生的免疫，导致BCG的接种可能选择性地促进MTB北京基因型现代株在人群中的传播[14]。

注“+”表示序列完整；“-”表示序列缺失

基于菌株基因组中大片段多态性分析证实，天津监狱羁押人群中至少有4个北京基因型MTB进化分支流行，其中RD150(+)的北京基因型现代株占全部116株北京基因型菌株的81.9%，明显高于其他3个北京基因型分支。天津地区普通人群中感染RD150(+)北京基因型现代株者占78.1%[10]，提示这一北京基因型进化分支无论是在普通人群中，还是监狱羁押人群中均为主要流行分支，而且在上述不同人群中肺结核患者感染RD150(+)北京基因型现代株的构成比相近。事实上，北京基因型在全球各地广泛传播流行也是由其现代株分支在人群的近期传播所导致[15]。引起这一北京基因型现代株广泛流行的机制还未完全阐明，采用小鼠肺感染模型对北京基因型不同进化分支菌株的毒性研究中证实RD150(+)北京基因型现代菌株较北京基因型古代株引发小鼠更快死亡，菌株对肺组织造成更大的病理损伤，提示这一进化分支具有更强的毒性[16]。在所有从天津监狱肺结核患者分离的菌株中，仅有1株北京基因型现代株中发生RD150差异区域的缺失，说明在RD150(-)北京基因型现代菌株在天津监狱羁押人群中并未广泛流行，同时也提示RD150差异区域的缺失并不能促进北京基因型MTB在人群中传播。虽然其他地区北京基因型菌株基因组中有RD142缺失的报道，但包括本研究在内我国不同地区基因大片段多态性对菌株进化研究中均未发现RD142缺失的北京基因型菌株，提示RD142差异区域在我国流行的北京基因型菌株中并不具备多态性。

综上所述，北京基因型MTB是天津监狱羁押结核病患者感染的优势菌株，至少发现4个北京基因型进化分支在监狱肺结核患者中流行；但结核病患者感染不同进化分支的比例存在较大的差异，RD150(+)北京基因型现代菌株是导致北京基因型在天津监狱羁押人员中传播的主要分支，提示该进化分支较其他进化分支具有更强的毒性。今后在针对引起北京基因型广泛传播的分子机制研究中应重点对RD150(+)北京基因型现代这一分支开展研究，同时也十分有必要着重针对RD150(+)北京基因型现代菌株的流行开展监测。