miRNA在肾脏缺血再灌注损伤中的作用研究进展

潘旭鸣 陈丹垒 马红珍

缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）是指组织或器官在缺血的基础上恢复血流后损伤反而加重，甚至出现损伤不可逆的现象。组织或器官缺血后缺氧，从而产生损害，但再灌注后却可能因为活性氧在组织或器官中的再度富集而造成二次损伤。研究发现，肾脏IRI是导致急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的主要原因之一[1]。缺血所致的低氧过程，与再灌注诱导的免疫应答反应激活共同成为肾组织损伤的原因，而IRI不可避免的存在于肾脏移植、心脏外科手术等过程中。尽管临床对肾脏IRI的研究颇多，但其确切机制尚未阐明，亦未发现良好的防治方法。

miRNA最早于1993年由Ambros研究小组在秀丽线虫的研究中发现[2]，其后miRNA被证实在各类物种中均具有高度的保守性。miRNA在基因转录后调控中起关键作用，并且参与了几乎所有细胞的生物学功能，包括细胞增殖、分化、代谢、凋亡等[3]，可与靶基因mRNA 3'端非编码区完全或不完全结合，在转录后水平调控蛋白质合成[4]。迄今为止，人类基因组已发现超2 000个miRNA。在生物体内，miRNA的特异性不强，一个miRNA可以作用于多个靶基因，包括转录因子、细胞因子、受体等，占人类基因1%的miRNA可能调控30%以上其他基因的表达，多个miRNA也可以共同调控一个靶基因的表达，因此，miRNA与靶基因之间组成了一个复杂的调控网络[4]。近年来，miRNA也被发现在疾病的诊断与治疗中扮演关键的角色。本文就miRNA在肾脏IRI中的作用研究进展综述如下。

1 肾脏IRI发生机制

肾脏IRI是造成患者发生AKI的主要原因，脓毒血症、休克、肾动脉狭窄、冠状动脉搭桥术或肾移植术等都可以通过肾脏IRI诱发AKI，其致死率与致残率较高。从病理上看，肾脏IRI以肾小管间质病变为主要表现，尤其以近曲小管损伤多见，并伴有小管上皮细胞的凋亡坏死与修复过程[5]。肾脏IRI可导致肾小管间质炎症、细胞凋亡与坏死、细胞修复能力减弱等，也可以通过激活免疫应答反应导致组织损伤[6-7]，其中炎症反应、氧化应激反应、细胞凋亡与细胞自噬在损伤发生过程中有着不可替代的作用。

1.1 炎症反应介导肾脏IRI 炎症反应在肾脏IRI过程中与各种类型细胞均有关，并且在病理生理机制中发挥关键作用。肾脏IRI会启动肾脏组织及细胞内的炎症级联反应，并导致损伤，因此抑制炎症反应是保护肾脏组织免受IRI的重要思路之一[8]。趋化因子是炎症反应中重要的中介分子之一，在炎症反应中起到调节并活化促炎因子，增强黏附分子表达的作用[9]。促炎因子如IL-6、TNF-α等在肾脏IRI致肾功能障碍过程中起到关键作用。研究显示，抑制IL-6及TNF-α表达后，可以在细胞水平减轻IRI导致的肾脏损伤[10-11]。同时，炎症介质、活性氧簇以及细胞黏附分子如细胞内黏附分子-1（ICM-1）、P-选择素等，可以通过募集白细胞与中性粒细胞至发生缺血的组织处，增强白细胞与内皮细胞之间的相互作用，促进内皮细胞肿胀并进一步阻碍血液的运行[12-13]，加重肾脏损伤。

1.2 氧化应激反应介导肾脏IRI 在肾脏IRI过程中，损伤的组织可以产生大量的活性氧簇，导致氧化应激反应发生，线粒体发生氧化磷酸化障碍，ATP生成减少，激活磷脂酶，造成生物膜损伤，细胞内钙内流而导致钙超载[14]。当血液再灌注后，产生大量的氧自由基，导致膜脂质过氧化反应，进而产生自由基介导的组织损伤[15]。自由基形成所导致的组织损伤借助膜脂质过氧化反应与蛋白质、DNA的氧化损伤可以促进细胞凋亡的过程[16]。因此，抑制自由基及其相关产物可以有效保护IRI的肾组织，减少损伤。

1.3 细胞凋亡与细胞自噬介导肾脏IRI 肾小管上皮细胞因急性缺血而出现细胞凋亡与细胞自噬反应是低血容量、低血压、心力衰竭等的共同病理环节[17]。肾小管上皮细胞坏死会引起水、电解质、大分子物质在细胞间扩散失控，造成肾小管滤过时产生回漏，使肾小球滤过率降低。研究发现，众多分子信号转导通路与肾小管上皮细胞坏死、凋亡及自噬相关。如p53-sestrin2信号通路及HIF-1α-BCL2信号通路等，均可在缺血的刺激下启动并激活，进一步改变肾小管上皮细胞的自噬及凋亡水平，具有潜在的保护作用[18]。低氧可以诱导mTOR及unc-51样自噬激活激酶1（ULK1）解离，诱导自噬产生[19-20]。细胞研究发现，ULK1与AMPK、c-jun、beclin-1等信号分子存在交互作用，从而介导细胞凋亡与自噬过程[19-22]。

2 miRNA在肾脏IRI诊断中的应用

近年来，寻找新型的生物标志物成为肾脏IRI研究的主要热点之一。miRNA的表达不仅可以逆转肾脏IRI，保护肾脏功能，更可以作为肾脏IRI诊断与鉴别诊断的生物标志物。肾脏IRI过程中miRNA的动态变化、其组织特异性表达模式与分析方法，甚至其在尿液和血液中的不同分布，均使得miRNA成为肾脏疾病生物标志物的理想候选者[23-24]。有学者对大鼠发生肾脏IRI后不同时间点的血清及肾组织miR-192进行检测，发现血清miR-192水平提高4倍但肾组织miR-192水平下降40%；该研究团队又选取93例心脏手术后患者血清进行验证后发现，心脏手术术后发生AKI的患者血清miR-192水平在进入ICU的同时开始升高，并在2h内维持稳定，24h后开始下降[25]，提示血清miR-192可以成为预测心脏手术后发生肾脏IRI的生物标志物之一。亦有研究指出，在小鼠IRI中，尿液miR-10a、miR-30d浓度与发生IRI后小鼠尿液中KIM-1及NGAL浓度呈正相关，反映了尿miR-10a与miR-30d浓度与小鼠IRI严重程度呈正相关[26]。在一项22例肾脏IRI患者的研究中发现，肾脏IRI患者尿miR-21水平是正常对照组的1.5倍，而尿miR-155水平则相较正常对照组显著降低，提示尿miR-21与miR-155均可以有效鉴别患者是否发生肾脏IRI，并具有一定的诊断效能[27]。

3 miRNA在肾脏IRI发生机制中的作用

部分miRNA被临床验证可作为肾脏IRI所致AKI的诊断生物标志物外，亦有大量研究发现miRNA可以作为信号分子参与肾脏IRI发生机制与病理生理过程，反映了其作为潜在的治疗靶点的生物学功能。

3.1 调节氧化应激反应 肾脏IRI过程中，由于细胞、组织缺血缺氧导致自由基、活性氧簇等大量激活，发生氧化应激反应，体内、外研究发现，部分miRNA可以阻断这一过程，减轻缺血及再灌注阶段对肾脏的损伤，降低肾功能受损程度。Muratsu-Ikeda等[28]采用低氧诱导HK-2细胞模型，模拟肾脏缺血缺氧环境后发现，低氧诱导后，细胞内miR-205水平明显下调，敲除细胞内miR-205基因后，HK-2细胞表现出对低氧环境更高的敏感性，对氧化应激的敏感性也相对升高，相对未敲除组细胞损伤程度更严重，细胞活力更差，补充miR-205后细胞活力有所恢复。进一步研究后发现，miR-205可以与细胞内脯氨酸羟化酶1（PHD1）结合，从而降低HK-2细胞对低氧环境及氧化应激反应的敏感性，最终提高细胞对低氧环境的耐受性。另有动物实验证实，在大鼠肾脏 IRI 后，miR-29a[29]、miR-34a[29]、miR-423-5p[30]、miR-320[31]在肾脏组织内的表达水平与肾脏组织氧化应激水平同步上调，在使用间充质干细胞治疗后肾脏组织内氧化应激水平及miR-29a、miR-34a均有所下降[29]；抑制大鼠肾脏组织miR-423-5p表达后，大鼠肾组织氧化应激反应减轻，肾脏损伤较未抑制的大鼠明显减小，miR-423-5p可能通过抑制谷胱甘肽转移酶M1（GSTM1）诱导氧化应激反应，减弱组织细胞损伤修复，从而造成组织损伤[30]；而miR-320水平上调所致的肾脏组织氧化应激反应与肾脏损伤表现均可以被卡托普利逆转[31]。

3.2 参与炎症反应 肾脏IRI过程中，在缺血缺氧阶段，炎症反应开始迅速启动，并产生级联放大效应而造成肾脏损伤。动物实验与细胞实验证实，肾脏IRI后，miR-21水平显著升高，通过抑制PTEN蛋白水平[32]，激活PI3K/AKT通路，从而抑制肾脏IRI过程中炎症因子的产生，减轻肾脏损伤[33]。同时，miR-21可以抑制丝裂原活化蛋白激酶3（MKK3）从而降低肾组织IL-6、TNF-α水平，减轻炎症反应，保护肾脏，减轻IRI[34]。Lan等[35]在小鼠肾脏IRI过程中发现，小鼠肾脏组织miR-494水平在IRI后1h开始升高，进一步研究证实，miR-494可以直接抑制转录因子ATF3，诱导炎症因子及黏附分子如 IL-6、P-选择素、单核细胞趋化因子-1（MCP-1）大量表达，加剧IRI后肾脏损伤。在利用脂肪间充质干细胞治疗肾脏血管性疾病的研究中发现，miR-26a可以抑制肾血管内TNF-α表达，升高IL-10水平，产生一定的抗炎作用[36]。而慢病毒转染miR-26a基因的小鼠在肾脏IRI后可以抑制IL-6表达并刺激调节性T细胞的生成，减轻肾脏炎症反应，促进肾脏IRI后功能的恢复[37]。对miR-146a敲除小鼠进行肾脏IRI过程模拟后发现，miR-146a可以通过调节IL-1受体相关酶1，从而影响CXCL8/CXCL1信号通路，相较于野生型小鼠，miR-146a基因敲除小鼠在肾脏IRI后，表现出更轻的肾小管损伤，更低的NF-κB等炎症因子水平[38]。

3.3 调节细胞凋亡与细胞自噬水平 在肾脏IRI过程中，缺血缺氧及再灌注后导致的自由基损伤、炎症反应、氧化应激反应最终均可导致肾小管上皮细胞自噬及凋亡反应产生，产生肾脏损伤。在低氧诱导NRK-52E细胞模型中发现，miR-21可以抑制细胞自噬。小鼠肾脏IRI模型中发现，miR-21基因敲除后，小鼠肾脏程序性细胞凋亡蛋白4（PCDP4）明显上调，加速细胞凋亡，加重肾脏IRI[39]。Cui等[40]对IRI小鼠肾脏组织进行miRNA芯片分析后发现，小鼠肾脏在IRI后miR-18a、miR-210表达明显异常，PTEN基因是miR-18a的目标基因，与p53凋亡信号通路有关，miR-210的靶基因为bcl2，同样可以调控细胞凋亡程度，影响肾脏IRI发生、发展。在肾脏IRI过程中，miR-687可以抑制PTEN蛋白，促进细胞周期与细胞凋亡[41]。Hao等[42]发现小鼠肾脏IRI后体内miR-17-5p水平明显升高。进行低氧诱导的肾小管上皮细胞实验发现，缺氧后细胞内miR-17-5p水平升高，依赖p53蛋白作用，直接抑制死亡受体6（DR6），减轻低氧导致的细胞凋亡，提示p53/miR-17-5p/DR6通路可能是小鼠IRI的重要发生机制之一。另有小鼠肾脏IRI实验证实，miR-34a在小鼠IRI后表达上调，可以通过结合Atg4B基因的3′非编码区，直接抑制肾小管上皮细胞的自噬活性，从而加重肾脏IRI[43]。Lorenzen等[44]发现，肾移植后发生急性排异反应的患者血miR-24水平明显上调，后在离体细胞模型中证实，低氧诱导肾小管上皮细胞后可以观察到miR-24在肾小管上皮细胞内特异性富集，并直接参与细胞凋亡过程，故推测抑制miR-24可能成为治疗肾脏IR的靶点之一。

4 miRNA介导肾脏IRI恢复

在肾脏IRI动物模型研究中发现，部分miRNA具有促进肾脏IRI恢复的作用。Zheng等[45]建立大鼠肾脏IRI模型后发现，miR-381在肾小管上皮细胞中可特异性结合CXCR4基因，抑制CXCR4基因及其相关蛋白质表达如SDF1、VEGF、HIF-1α等，从而增强肾小管上皮细胞增殖，减轻上皮细胞凋亡，促进大鼠肾脏IRI恢复。Song等[46]建立了特异性敲除小管上皮细胞miR-17-92小鼠模型，并对其造成肾脏IRI，结果发现，敲除miR-17-92的小鼠肾脏缺血再灌注后损伤程度较正常小鼠更为强烈，在外源性补充miR-17-92后可以部分逆转缺血再灌注造成的肾脏损伤，提示miR-17-92具有潜在治疗肾脏IRI的作用。

5 miRNA与低氧诱导因子（HIF）在肾脏IRI中的作用

HIF活化在IRI缺血或者低氧阶段起重要的作用[47]。HIF的转录活性受HIF-α特定残基的翻译后羟化作用调节。HIF的靶点包括负责血管舒缩调节基因（如肾上腺髓质素、eNOS、血红素加氧酶）、能量代谢（如GLUT-1、碳酸酐酶-9）、血管生成的信号（如血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体-1）和细胞保护作用（如肾上腺髓质素、促红细胞生成素、血管内皮生长因子、HSP70）。因此，适当激活HIF可以改善缺血细胞存活状态，并促进有益的适应性变化。抑制HIF-1α羟化酶从而稳定甚至激活HIF已成为许多疾病如心肌缺血、缺血性脑卒中和急、慢性肾损伤的治疗策略与研究热点之一[48-49]。研究发现，miRNA可受HIF-1α调控从而影响肾脏IRI过程。Aguado-Fraile等[50]发现，在大鼠肾脏IRI模型中，大鼠miR-127明显上调，进一步的细胞学实验显示，miR-127上游受HIF-1α调控，下游调控驱动蛋白家族3B（KIF3B），参与细胞黏附、细胞内骨架稳定及细胞内信号分子传导等生理活动。Wang等[51]通过低氧诱导HK-2细胞模拟肾脏IRI过程发现，低氧损伤后HK-2细胞内miR-20a-5p水平显著减少，并发现miR-20a-5p受HIF-1α调控，并可以与自噬相关16样蛋白1（ATG16L1）的mRNA的3′端相结合，从而影响肾脏IRI过程中细胞自噬水平。Wei等[52]研究表明，肾脏IRI过程中HIF-1α可以通过减少miR-489的生成，增加细胞凋亡水平从而加重肾脏IRI损伤。Bhatt等[41]亦观察到miR-687在小鼠肾脏IRI过程中受HIF-1诱导，并通过HIF-1/miR-687/PTEN信号通路在小鼠肾脏IRI过程中调控细胞凋亡。

6 小结与展望

肾脏组织不同类型的细胞可能在不同的肾脏疾病中受到影响。为了解miRNA发挥的具体病理生理作用，有必要确定在具体肾脏疾病的情况下表达此miRNA的细胞类型。具有条件性过度表达或基因敲除的转基因动物模型可能是研究miRNA在肾脏疾病中的作用和调控的最佳模型。在一定条件下识别miRNA调控及其靶基因变化的意义是目前临床难点，因为单个蛋白质可以由多个miRNA调控，单个miRNA可以调节多个蛋白质。虽然miRNA对肾脏IRI的调节是一个令人兴奋的新兴研究领域，但更重要的是需要建构肾脏IRI过程中miRNA表达谱的变化，并完善miRNA-mRNA在肾脏IRI过程中的网状对应作用。最终，通过信号通路分析等明确每一个miRNA在肾脏IRI过程中的具体靶点、作用机制及病理生理影响。值得注意的是，目前鉴定出的大多数miRNA都是差异表达的，并可以通过调节细胞凋亡、增殖、自噬等来抑制损伤反应，这可能为临床指明了靶向调节肾脏IRI的新思路；同时也应该注意到HIF与miRNA之间的相互作用等新的IRI机制成为研究热点的可能性；其次，在肾脏IRI的研究中，使用生物信息学技术对miRNA进行芯片检测及通路分析的研究尚不丰富，芯片数据的检测以及生物数据的挖掘将来可能成为肾脏病研究的热点之一，也符合目前提倡的精准医学理念，期待在今后的肾脏IRI研究中看到更多相关研究。