SNP技术在葡萄研究中的应用进展

张正文，王咏梅，任凤山，赵艳侠，王鹏飞，邵学东*

（1. 君顶酒庄有限公司，山东蓬莱 265607；2. 山东省葡萄研究院/山东省葡萄栽培与精深加工工程研究中心/农业部华东都市农业重点实验室，山东济南 250100）

SNP指的是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，全称为Single Nucleotide Polymorphism，是目前被发现的第三代遗传标志。单核苷酸变异的原因包括转换、颠换、缺失和插入，其数量很多，多态性丰富。一般而言，SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异[1]。SNP技术是目前最新一代的分子标记技术，应用于分子标记的优点是分布广、多态信息量大、易于检测和统计[2]。SNP分子标记在葡萄研究中的应用前景包括：（1）作为分子标记应用于鉴定品种；（2）在杂交育种中作为分子标记确定杂交后代；（3）作为分子标记应用于遗传图谱的构建及QTL的鉴定；（4）作为分子标记应用于全基因组关联分析（Genome-wide association study，GWAS）分析；（5）应用于葡萄分子设计育种。在所有SNP的检测方法中，对DNA片段进行直接扩增、测序是最为准确的方法。目前常用的SNP检测方法包括全基因组测序法、全基因组SNP芯片、SNPlex系统检测法等。

1 前、后基因组时代过渡阶段SNP在葡萄研究中的应用

早在2004年，就有研究者开始研究葡萄中的SNP。Chevreux等人开发了一个EST（expressed sequence tags，表达序列标签）序列组装器，该程序可以基于EST序列检测和分类不同变异的SNP[3]。当时葡萄及大部分植物基因组测序尚未完成，所以葡萄SNP的研究只能基于EST库等数据。2007年，Troggio等[4]利用酿酒葡萄‘西拉’和‘黑比诺’作为父母本构建杂交群体，绘制了基于483个SNP的葡萄遗传连锁图谱。当时葡萄基因组尚未公布，下一代测序技术还较为落后，当时他们利用PCR扩增EST片段技术进行SNP分析。2008年，Vezzulli等[5]利用3个酿酒葡萄的杂交组合构建了一个综合参考遗传图谱，该图谱的构建应用了501个SNP。该研究鉴定SNP的方法已经更新为EST文库测序和细菌人工染色体测序（BAC-end sequences），技术上比PCR扩增测序有了较大进步[5]。那时葡萄基因组数据刚刚被公布[6]，但还没有被广泛应用。因此也未能被应用到该研究中。同年，Lijavetzky等[7]很快利用葡萄基因组数据开发了葡萄基因组重测序法（re-sequencing approach）和SNPlex系统分析技术用于高通量分析葡萄SNP。他们在葡萄中使用了SNPlex基因分型技术，并在2008年将研究葡萄SNP多态性的研究成果公布[8]。同年，Pindo[9]紧随其后利用SNPlex系统鉴定了563个葡萄的新SNP。此后葡萄SNP技术的发展主要围绕葡萄基因组数据，下一代测序技术及高通量芯片领域。2009年，由于下一代测序技术的进步，简化基因组文库（Reduced representation libraries，RRLs）技术出现。同年，Myles等[10]利用该技术从17个葡萄品种（10个栽培品种和7个野生种）中鉴定了几十万个SNP，并开发了9K genotyping芯片技术，为葡萄品种、种间鉴定和SNP分型提供了足够的分辨率。了解种间的关系是进化生物学的一个基本目标，通过下一代测序和相关技术鉴定的SNP使葡萄种间系统发育分析成为可能。2013年，Miller等[11]提出了利用SNP技术发展葡萄系统基因组学，并认为利用SNP技术分析葡萄种间进化关系比表型观察更为准确。2015年，De Lorenzis等[12]开发了vitis18SNP芯片，用来分析71个格鲁吉亚特有栽培及野生葡萄种质，并鉴定出18775个SNP。

随后2015—2016年的几项研究，标志着SNP技术应用重心从鉴定葡萄品种的研究转为QTL、功能基因及表型相关SNP的研究。2015年，Chen等[13]利用下一代限制位点相关DNA测序（restriction site associated DNA-seq，RAD-seq）技术，在复杂亲本的酿酒葡萄杂交种[(V.vinifera×V.amurensis)×(V.labrusca×V.riparia)×V.vinifera]中共发现1826个SNP。基于此构建了高密度遗传图谱，并首次定位了控制葡萄中单糖（果糖、葡萄糖）和酸（苹果酸和酒石酸）的QTL。2015年，Houel等[14]用18K SNP芯片对129株来自于‘Picovine×白玉霓’Flb的杂交群体进行基因分型，并在亲本图谱上鉴定出10个稳定的关于葡萄果实发育和品质或叶面积的QTL。2016年，Zyprian等[15]基于151个葡萄个体的SNP分析，定位出一个位于18号染色体的抗霜霉病的主效QTL，和一个位于15号染色体的抗白粉病的主效QTL。2015年，Tello等[16]鉴定出葡萄果实数目和果穗第一分枝长度相关的SNP。2015年，Pereira等[17]对22不同葡萄品种中花色苷合成途径中的chalcone isomerase（CHI）和UDP-glucose:fl avonoid 3-O-glucosyltransferase（UFGT）基因进行SNP分型鉴定。结果显示，CHI基因在序列中呈现5个单核苷酸多态性，在UFGT基因中共发现58个SNP，从而可利用这些SNP区分22个品种中的18个不同基因型[17]。虽然很多SNP与葡萄表型的关联分析被研究，但当时还没人开始尝试葡萄GWAS研究。2016年，Catalano等[18]将SNP技术应用于葡萄酒鉴定，开发了一种基于SNP的葡萄酒可追溯性方法。

2 近3年SNP技术在葡萄研究中快速发展

2017—2019年，SNP技术应用于葡萄研究的目的和手段虽无革命性改变，但研究总量有了大幅提升。这与下一代测序、芯片技术的高速发展相关。这期间，我们搜索到至少15篇相关的高水平SCI论文。GWAS这种基于SNP技术的研究方法在葡萄中开始被应用。2019年，Guo等[19]利用GWAS分析，鉴定出了葡萄果实重量、味道、纹理等表型相关的QTL。同年，Liang等[20]利用GWAS分析，鉴定出了葡萄果实性状、芳香化合物等表型相关的SNP和基因。2018年，Lauco等[21]利用18k SNP genotyping array芯片探测了783个葡萄品种中的10207个SNP，并利用GWAS技术分析了与葡萄基本表型相关联的SNP。2018年，Sapkota等[22]利用GWAS技术定位出‘诺顿’（Norton）葡萄抗霜霉病相关的QTL。

此外，2018年，Smith等[23]鉴定了根结线虫和黄褐变线虫抗性关联的SNP。2018年，Ma等[24]利用重测序鉴定SNP的方法研究东亚野生葡萄种的系统发育关系及迁徙路线。结果表明，东亚葡萄最可能的迁徙路线是从东北亚向南，到南亚和东南亚。其他相关研究还包括：利用SNP基因分型阐明麦格纳（Magna Graecia）葡萄种质遗传多样性及其传播的历史渊源[25]，用于鉴定葡萄品种的SNP探测平台发展[26]；利用高通量测序鉴定SNP，解释葡萄进化关系，北美种和欧亚种葡萄之间的关系[27]；利用SNP技术研究圆叶葡萄和欧洲葡萄的杂交渗入情况[28]；利用SNP技术研究意大利撒丁岛葡萄品种的序列多态性和结构变异[29]，野生和栽培葡萄SNP的探测等[30]；利用SNP技术研究格鲁吉亚葡萄品种的亲缘关系[31]；葡萄的驯化、糖度、香气的人工选择研究等[32]。

2018年日本一项新规则规定，以产自日本的葡萄原料酿造的葡萄酒应标为“日本葡萄酒”。日本酿酒葡萄品种‘甲州’（Kosyu）是通过SNP技术认定的日本本地品种。其酿造的葡萄酒带有柑橘香味。‘蓓蕾玫瑰’（Muscat Bailey）也是日本培育的本地品种，它特有的芳香已确认是呋喃妥所致。这些特点也已经被找到相关的SNP，用来鉴定日本葡萄酒[33]。

3 感想和展望

SNP技术在葡萄研究中突飞猛进的发展，对于葡萄育种、新品种鉴定、功能基因等领域的研究意义重大，推动了葡萄基础研究领域的发展，进而能推动葡萄和葡萄酒产业的快速进步。后基因组时代，SNP技术得到了广泛的应用，并大放异彩。

目前葡萄研究中还存在很多的问题，可以利用SNP技术解决。例如，我们如何更好的确定杂交后代？作者认为利用全基因组测序技术检测子代中含有父母本SNP的比例是一个较为科学的方法[21]，这比简单的用几个分子标记去检测更为可信。随着SNP技术的完善，进一步推动检测成本降低，也许该技术将来会成为一个检测杂交后代的金标准。目前，SNP在分子设计育种中的应用报道较少，相信将来会增多。预测SNP技术对分子设计育种也将起到重要作用。