环状RNA在肺癌中的研究进展

赵 敏，邸 鑫，金 鑫，田 畅，刘伽莹，丛 珊，王 珂，李然伟

(吉林大学第二医院 1.呼吸与危重症医学科;2.肿瘤血液科;3.泌尿外科，吉林 长春130041)

根据国际癌症研究机构2018年报道的数据显示，肺癌是世界上最常见的癌症(占总病例的11.6%)，并且是癌症相关死亡的主要原因(占总癌症死亡人数的18.4%)[1]。其中，非小细胞肺癌(NSCLC)占病理类型的85%，而肺腺癌(LUAD)和肺鳞状细胞癌(LUSC)是最常见的亚型。与NSCLC相比，具有快速倍增时间和早期广泛转移特点的小细胞肺癌(SCLC)，由于缺乏早期检测方法[2]，5年生存率一般低于7%，大多数患者在确诊后仅存活1年或更短[3]。对肺癌发病机制的积极探索表明，识别新的肺癌相关生物学标志物对于促进肺癌患者的治疗和预后可能是至关重要的，因此，研究肺癌相关的分子机制和信号传导途径是重要的。

环状RNA(circRNAs)是一类非编码RNA，于1976年首次通过电镜在RNA病毒中被发现。Memczak等人通过RNA测序鉴定出1950种人类环状RNA，1903种小鼠环状RNA和724种线虫环状RNA。大量研究证实环状RNA在许多人类疾病如癌症[4]，心脏疾病[5]，神经系统疾病，糖尿病和免疫系统疾病[6]等的发生和发展中发挥重要作用。此外，越来越多的研究表明，环状RNA可能与肿瘤增殖，凋亡，侵袭和转移密切相关，这些证据表明环状RNA具有作为新的生物标志物和治疗靶点的潜力，且环状RNA的调控可能是肺癌机制、诊断和治疗中不可或缺的一部分[7]。

1 环状RNA的功能

1.1 ceRNA或miRNA海绵

由外显子组成的EcRNA具有稳定的环状结构，并且大多数包含miRNA响应元件(miRNA response element，MRE)。因此，ecRNA可以作为高效内源RNA，有效吸附miRNA并阻止它们与靶mRNA相互作用[8]。

1.2 调节选择性剪接或转录

EIciRNA和ciRNA主要位于细胞核中，已被证明可调节亲本基因的转录。外显子环状RNA如circEIF3J和circPAIP2可与RNA聚合酶II(Pol II)结合并调节其宿主基因的表达水平。在前体RNA剪接的过程中，反向剪接产生的环状RNA可以竞争性调节可变剪接。

1.3 与RNA结合蛋白(RBPs)相互作用

环状RNA可与RBP结合来发挥生物学功能。当环状RNA与RBPs和核糖核蛋白复合物结合时，可以起到RNA结合蛋白海绵作用以及“储存”功能。

1.4 翻译蛋白质

环状RNA编码蛋白质的功能仅在丁型肝炎病毒中得到证实[9]，研究表明，在真核生物中，具有内部核糖体进入位点(IRES)的环状RNA能够进行有效的翻译[10]。Legnini等人发现circZNF609具有开放阅读框(ORF)，其两端分别含有起始密码子和终止密码子，通过多核糖体翻译产生蛋白质[11]。此外，研究证实，天然真核内源性环状RNA通过腺苷N6(m6A)的甲基化来驱动蛋白质翻译。

2 环状RNA和肺癌

研究表明，环状RNA在各个组织类型的肿瘤的存在差异表达[12，13]。高通量测序证明了与正常组织相比，肺癌组织中存在大量差异的环状RNA，提示环状RNA参与了肺癌的发生和发展过程。

2.1 肺癌中环状RNA的表达

研究表明，肺癌患者的组织和血浆中存在诸多环状RNA差异表达。Jiang等人报道了与邻近正常组织相比，在非小细胞肺癌组织中环状RNA微阵列显示共有957个环状RNA异常表达。在另一项研究中，Ding等人应用RNA测序技术检测9例肺腺癌(LUAD)和非肿瘤组织(每三个样本混合为一组)。环状RNA预测算法鉴定出5750个环状RNA，包括3590个新的环状RNA转录本，其丰度低于mRNA和lncRNA。大多数环状RNA的长度均小于1000nt，中位长度约为530nt。Xu等人使用环状RNA微阵列分析发现，与相邻正常组相比，3个LSCC中有216个环状RNA差异表达，其中135个上调，81个下调。在另外40对LSCC组织中，Kaplan-Meier生存分析显示，具有hsa_circ_RNA_103827高表达和hsa_circ_RNA_000122低表达的LSCC患者的总生存时间明显缩短。提示环状RNA可能是肺癌诊断和预后的潜在标志物。随着更多与肺癌相关的环状RNA被发现，环状RNA的作用将受到更多的关注。

2.2 环状RNA与肺癌的增殖和进展

2.2.1环状RNA通过作为microRNA海绵调节肺癌的增殖和进展 研究表明，在肺腺癌肿瘤组织中，circRNF13下调接近2.98倍，其表达水平与肿瘤的TNM分期和淋巴结转移呈显著负相关。随后细胞学分析显示，位于细胞质中的circRNF13可与RNA结合蛋白Ago2相互作用，作为miR-93-5p的海绵。

同样，hsa_circ_0007385在NSCLC组织和肺癌细胞中显著上调。体外实验证实，其可通过吸附miR-181显著抑制NSCLC细胞的增殖，迁移和侵袭，并显著降低基因敲除异种移植肿瘤的生长。此外，肺腺癌组织环状RNA微阵列中hsa_circ_0012673表达上调，其表达水平与肿瘤大小相关。 环状RNA通过海绵作用miR-22靶向于erb-b2受体酪氨酸激酶3(ErbB3)，以促进肺腺癌细胞的增殖。并且，circMAN2B2通过海绵作用miR-1275促进FOXK1表达，从而在肺癌中发挥致癌作用[15]。circ-BANP介导的miR-503/LARP1信号通路促进肺癌的生长，迁移和侵袭[16]。

上述研究表明，环状RNA可能通过吸附相关的miRNA参与增殖，分化，迁移和致癌过程，为调控癌症进展提供了新方向。

2.2.2环状RNA通过癌症相关的信号传导途径调节肺癌的增殖和进展 诸多研究表明，多种信号通路参与异常的生物过程，如肿瘤增殖，细胞凋亡和侵袭。越来越多的数据表明，环状RNA可通过直接调控靶基因或miRNA，从而改变与肺癌发生，增殖，转移和侵袭的相关的信号传导途径。

研究表明，Wnt/β-catenin连环蛋白通路的异常激活在肺癌的发生，发展和转移中起关键作用[17]。E3泛素(Ub)蛋白连接酶(ITCH)抑制肿瘤中的Wnt/β-连环蛋白。主要是通过促Dvl2泛素化和抑制其磷酸化来加工。环状RNA-ITCH(cir-ITCH)具有多个miRNA结合位点，可通过吸附miR-7，miR-17和miR-214而升高ITCH水平进而抑制Wnt/β-catenin细胞通路。 Wan等人发现cir-ITCH表达在肺癌组织中显著减少。cir-ITCH可显着上调亲本抑癌基因ITCH的表达，从而抑制肺癌细胞的增殖。功能学分析显示，cir-ITCH吸附miR-7和miR-214增强了ITCH水平[18]。Tian等人也发现，在用肉桂醛(CA)处理NSCLC细胞后，NSCLC细胞中hsa_circ_0043256表达上调，进而可以抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，可以作为miR-1252海绵靶向ITCH发挥其抑癌作用。

CircHIPK3是一种来源于HIPK3基因的外显子2的丰富的环状RNA，具有18个潜在的miRNA结合位点。研究报道，circHIPK3可结合多种miRNA，包括miR-124和miR379，并在肺癌细胞系中具有促进增殖活性，同时通过海绵miR-379调控胰岛素样生长因子1(IGF1)的表达。研究发现，CircHIPK3作为miRNA-124的海绵，调控miR-124-mRNA靶基因SphK1，CDK4和STAT3在肺癌细胞中的表达。在NSCLC中，miR-379可以增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，从而增强顺铂的杀伤能力[19]。上述结果提示circHIPK3参与肺癌的调控，可能成为NSCLC治疗的新靶点。

前期研究显示TGF-β可能促进上皮细胞间质转化(EMT)和NSCLC细胞的侵袭。最近，我们已经提供了证据，转录中间因子1γ(TIF1γ)通过TGF-β/Smad信号通路增强TGF-β诱导的NSCLC细胞EMT。Wang等人研究发现circPTK2在转移性NSCLC组织表达明显降低。进一步的功能学实验发现，海绵吸附miR-429/miR-200b-3p进而靶向TIF1γ以促进TGF-β诱导的EMT在NSCLC转移中的作用，为NSCLC的诊断和治疗提供了新的策略。

上述研究表明，环状RNA可能通过癌症相关的信号通路诱导肺癌的增殖和进展。

2.3 环状RNA作为肺癌的潜在诊断生物标志物

在人唾液和外周血中，数百种环状RNA比同源线性mRNA表达更高，更容易检测，表明环状RNA可能是非侵入性检查中令人满意的生物标志物[20]。

大多数癌症的早期诊断可以显着提高治疗效果。鉴于CT，MRI，组织病理学等其他相关检查的高成本和有创性，因此我们迫切需要一种微创且廉价的方法。根据目前的研究，环状RNA具有以下特征：(1)环状RNA可免受核糖核酸酶和核酸外切酶降解，比线性RNA具有更长的半衰期和更强的稳定性;(2)环状RNA在不同物种间具有高度的进化保守性[44];(3)环状RNA在细胞质和细胞核中均有分布。大部分环状RNA在细胞质中富集，其丰度有时比相应的线性mRNA高10倍以上，这可能是由于环状RNA比线性RNA更稳定造成的[21];(4)环状RNA具有组织特异性。环状RNA的组织特异性可以使它们成为特定组织疾病的诊断因子[22];(5)环状RNA具有较高的丰富和丰富的种类。因此，上述特征使环状RNA作为肺癌诊断和预后的潜在生物标志物具有明显优势。

据报道，hsa_circ_0013958在肺腺癌组织、细胞和血浆中均上调。此外，hsa_circ_0013958水平与TNM分期和淋巴转移相关。受试者工作特性曲线下面积(AUC)为0.815。hsa_circ_0013958诊断肺腺癌的灵敏性和特异性分别为0.755和0.796。血浆hsa_circ_0013958的曲线下面积(AUC)为0.794。因此，hsa_circ_0013958在诊断早期肺癌方面可能优于诊断晚期肺癌[47]。

棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因存在于4%的NSCLC病例中。EML4-ALK产生EML4-ALK融合蛋白激活ALK相关的致癌信号,促进NSCLC进展[23]。越来越多的证据表明，融合基因剪接的环状RNA可能是除融合蛋白外参与癌症发展的另一个实体。Tan等人从EML4-ALK-v3b发现了带有AA基序连接位点的环状RNA，F-circEA-2a[24]。此外，F-circEA-2a几乎不影响细胞增殖，但可促进NSCLC细胞的迁移和侵袭。进一步分析显示F-circEA可能存在于EML4-ALK阳性患者的血浆和肿瘤组织中。而融合基因EML4-ALK的mRNA仅存在于肿瘤组织中，并且不能在血浆中检测到。该研究指出，由EML4-ALK融合基因产生的F-circEA可能是NSCLC的新型液体活检的诊断标志物。因此，F-circEA在NSCLC患者中诊断EML4-ALK和使用ALK抑制剂克唑替尼的使用具有潜在价值。

衍生自苯丙氨酸-tRNA连接酶亚基α(FARSA)基因的外显子5-7的环状RNA，称为circFARSA，在癌组织中显著上调并且在相应的血浆中含量丰富。而正常人血浆中FARSA mRNA的水平太低而无法检测[25]。进一步分析血浆circFARSA在区分NSCLC患者和非癌症患者中的诊断价值，ROC曲线下面积为0.71，提示血浆circFARSA可作为非侵入性检测NSCLC的生物标志物。肺癌细胞系中circFARSA过表达促进细胞迁移和侵袭。在硅酸盐分析中，circFARSA可能海绵化miR-330-5p和miR-326，导致其对癌基因脂肪酸合成酶的抑制作用减弱。

2.4 肺癌中环状RNA的预后评估

预后评估在延长癌症患者的生存方面起着重要作用。许多研究表明，环状RNA参与肺癌的多种病理过程。因此，环状RNA作为肺癌的潜在预后生物标志物正受到越来越多的关注。

据报道，circRNA_100876对肺癌患者有预后价值。Yao等人测试了101个NSCLC样本，包括51个鳞状细胞癌(SCC)样本和50个腺癌(ADC)样本[26]。与正常组织相比，肿瘤组织中circRNA_100876的表达水平上调1.23倍，与NSCLC淋巴结转移及肿瘤TNM分期正相关。环状RNA 100876高表达NSCLC患者的总生存时间明显短于circRNA_100876低表达NSCLC患者，表明circRNA_100876可能是预测预后的风险因子之一。

在非小细胞肺癌组织中hsa_circ_0003998[27]，hsa_circ_001569，hsa_circ_RNA_103809[28]，hsa_circ_0016760，hsa_circ_0067934[29，30]，hsa_circ_0020123，circFADS2[31]和circFGFR3的高表达，患者的总体生存率短。其中hsa_circ_0003998与肿瘤体积增大和淋巴结转移相关。hsa_circ_006793，hsa_circ_001569，hsa_circ_0016760，hsa_circ_0067934和circFGFR3表达的上调与晚期TNM分期和淋巴结转移相关。circFADS2和hsa_circ_0020123高表达与晚期TNM分期，淋巴结转移、分化差相关。 hsa_circ_0000064在肺癌组织中表达上调，其异常表达与多种临床特征相关，包括T分期，淋巴结转移和TNM分期[32]。

基于这些发现，环状RNA显示出在肺癌诊断和预后方面的潜力。在将这些发现应用于临床患者之前，可能需要更多的研究。

2.5 环状RNA在肺癌中的治疗潜力

许多环状RNA已被证明与肺癌的增殖和进展有关，并且还显示出其作为肺癌治疗靶点的潜在作用。

Lin等人建立了裸鼠异种移植模型，与对照组相比，siRNA转染的细胞衍生肿瘤和si-circPRKCI转染的细胞衍生肿瘤体积更小，重量更轻。源自患者的肿瘤异种移植物(PDTX)可以更好地维持原发患者肿瘤的细胞分化能力，形态和结构。实验者通过瘤内注射胆固醇偶联si-circPRKCI和对照siRNA来评估circPRKCI的治疗潜力。结果表明，si-circPRKCI显著抑制体内PDTX的生长，表明circPRKCI可能是肺腺癌有希望的治疗靶点。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)已广泛应用于EGFR突变型肺腺癌患者，增殖实验表明，与单独的吉非替尼或si-circPRKCI相比，吉非替尼联合沉默circPRKCI具有较强的抑制作用，提示联合EGFR和circPRKCI可能具有潜在的协同抑制作用，说明circPRKCI可能是一种潜在的治疗靶点。

Zhang等人报道了NSCLC组织中CDR1表达量最高，与miR-7的表达呈负相关，与TNM分期，淋巴结转移和短暂的总生存时间(OS)有关[33]。CDR1水平是NSCLC患者的独立预后因素。CDR1as可诱导细胞活力和生长，影响细胞凋亡和G1/S阻断，并通过海绵吸附miR-7关键靶基因EGFR，CCNE1和PIK3CD。多项研究表明miR-7可能是EGFR介导的肿瘤发生的重要调控因子，提示CDR1as/miR-7可能成为肺癌新的潜在治疗靶点。

2.6 环状RNA和肺癌耐药性

由于NCSLC缺乏敏感的生物标志物，许多患者被诊断时即为疾病晚期，从而限制了手术切除的机会。紫杉醇是一类具有有效抗肿瘤活性的二萜类生物碱，在肺癌的治疗中发挥着重要作用;然而，紫杉醇治疗目前正面临挑战[34]。Xu等人应用高通量环状RNA微阵列研究亲本A549和紫杉醇抗性A549/紫杉醇(A549/Taxol)细胞的环状RNA表达谱。与A549细胞相比，他们在A549/Taxol细胞中检测到2909个显著上调和8372个下调的环状RNA。与具有下调的环状RNA的A549细胞相比，随后应用生物信息学分析发现，许多调节肺癌化学敏感性的miRNA可能与差异表达环状RNA相互作用。值得注意的是，hsa_circ_0071799的上调与miR-141相关，并且下调的hsa_circ_0091931与miR-34c-5p相关。通过下调卵巢癌细胞中miR-141导致E-钙粘蛋白、波形蛋白和纤连蛋白上调，引发间充质转换和β-微管蛋白同种型TUBB3的上调，导致细胞对紫杉醇和卡铂产生抗性[35]。在肺癌中，MiR-34c-5p通过沉默其靶基因bcl-2修饰因子(Bmf)和c-myc[36]来下调p53，从而抑制紫杉醇介导的细胞凋亡。

目前，表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)，主要包括厄洛替尼，埃克替尼和吉非替尼，是EGFR突变NSCLC的一线药物。有证据表明EGFR-TKIs治疗明显限制了其对NSCLC患者的临床疗效，EGFR-TKI的确切发病机制和耐药机制尚不清楚。Zhou等人发现hsa_circ_0004015在NSCLC组织和TKI抗性NSCLC细胞系HCC827I/R表达上调，可促进肺癌细胞的活力、增殖和侵袭，功能分析表明，hsa_circ_0004015能显著增强HCC827细胞对吉非替尼的耐药能力。沉默hsa_circ_0004015增强了HCC827I/R细胞对吉非替尼的敏感性。对miR-1183的海绵靶向PDPK1基因的进一步分析表明，PDPK1可介导AGC蛋白激酶家族在细胞增殖，代谢和凋亡中的调控作用，因此可作为Akt-mTOR信号通路的重要组分[37]。这些结果表明hsa_circ_0004015可能在NSCLC的肿瘤发生和耐药性中起作用。

2.7 环状RNA在小细胞肺癌中的作用

与NSCLC相比，SCLC表现出快速倍增时间和广泛转移等特点。但目前对SCLC中环状RNA的研究少见报道。

最近的一项研究表明，在SCLC组织中FLI1外显子环状RNA(FECRs)，FECR1(外显子4-2-3)和FECR2(外显子5-2-3-4)表达异常上调并与淋巴结转移呈正相关[38]。在SCLC细胞中抑制FECR表达可显着抑制细胞迁移并减少移植瘤在体内的转移。功能分析表明，FECRs可吸附miR584-3p激活含Rho相关卷曲蛋白激酶1基因(ROCK1)。此外，还发现FECR1在血清外泌体中的血清胞吐作用与生存率低和临床化疗反应相关。这些结果表明FLI1外显子环状RNA可能是SCLC的致癌驱动因子。

3 结论与展望

环状RNA是一类非编码RNA，具有与海绵，剪接，转录，与蛋白质相互作用，翻译和调控肿瘤等相关功能。近年来，许多研究探讨了环状RNA的临床价值。本文综述了肺癌相关环状RNA的表达、调控肺癌增殖，凋亡，侵袭机制、肺癌诊断，以及生物标志物和治疗潜力。本文不仅新增了诸多最新的研究，关注了环状RNA在肺癌的发病机制，诊断，治疗和耐药性中的作用。围绕环状RNA还存在许多问题需要进一步阐明：(1)对环状RNA调控网络的进一步研究可能阐明相关疾病的潜在机制。(2)尽管环状RNA具有多种作用，但对其在肺癌中的其他作用知之甚少。(3)当前的环状RNA研究必须扩展到包括非侵入性和疾病相关的样本。(4)CicrRNAs显示出潜在的治疗效果。开发能够准确靶向作用位点的稳定环状RNA是重要的。深入研究这些问题，可以提高我们对肺癌中环状RNA功能的理解。