紫地榆不同提取物体内防龋研究

卢 燕，李秋艳，李茹芳，蓝 海，2*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.滇西应用技术大学公共基础教学部，云南大理 671006）

龋齿又称“蛀牙”，是一种常见的牙组织被慢性破坏的感染性疾病〔1〕。龋病由细菌、食物、个体等多种因素引起，影响牙齿的美观、发音，更严重地影响了牙齿的功能〔2〕，龋病可直接损害牙釉质、牙本质和牙骨质，若不及时治疗，一个很小的龋洞会不断发展并最终损害整个牙体，造成严重后果。前期体外实验发现紫地榆不同提取物有一定的防龋作用〔3-4〕。本实验将研究紫地榆不同提取物在动物体内是否也有防龋作用。

1 材料

1.1 主要仪器Y135型中药材粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；COOL SAFE95-15冷冻干燥机（Genen Company Limited）；XTL-3B体视显微镜（重庆光学仪器厂）。

1.2 药液配制将紫地榆根粉碎，称取20 006.98 g，用95%工业乙醇浸泡48 h，旋蒸得到浸膏，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯和正丁醇部分（以下分别称为乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物），冷冻干燥成粉末，均用蒸馏水将其配置成2 mg∕mL溶液。

1.3 细菌、培养基、动物、饲料变形链球菌（Streptococcus mutans，ATC25175）；TPY液体培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）；琼脂（北京索莱宝科技有限公司）；TPY固体培养基：每100 mL TPY液体培养基中加2 g琼脂，高压灭菌；SD大鼠，共40只，雌雄各半，体质量约200 g，购买于昆明楚商科技有限公司，合格证号：SYXK（滇）2011-0004；致龋饲料2000#〔5〕，购买于北京博泰宏达生物技术有限公司。

2 方法

2.1 内源性细菌的除去SD大鼠40只，用普通饲料喂养1周。在大鼠饮用水中加入氨苄西林2.4 mg∕mL、链霉素0.5 mg∕mL，除去大鼠口腔内的内源性细菌，连续3 d。第3天用棉签取大鼠口腔唾液，接种在TPY固体培养基上，37℃厌氧培养48 h，观察口腔内细菌生长情况。实验大鼠从第3天开始至实验结束都喂养致龋饲料2000#。

2.2 变形链球菌的培养本实验选用变形链球菌作为口腔致龋菌〔6〕。用接种环将冻存的变形链球菌接种在TPY固体培养基上，放在厌氧培养袋中，加入产气袋，放入恒温培养箱中，37℃培养48 h。将复苏的变形链球菌转种至TPY液体培养基中，37℃厌氧培养24 h，离心，取下面的细菌。

2.3 接种细菌用生理盐水将菌液配成5×107CFU∕mL，用移液枪量取0.8 mL于1 mL离心管中，用棉签蘸取接种于大鼠口腔内，剩余的用灌胃针注入大鼠口腔，连续3 d。第3天蘸取大鼠口腔唾液，接种在TPY固体培养基中，37℃厌氧培养48 h，观察变形链球菌生长情况。

2.4 给药第5天将大鼠分成4组，每组10只，雌雄各半。分别用蒸馏水配制的2 mg∕mL紫地榆乙酸乙酯提取溶液、2 mg∕mL正丁醇提取溶液、0.1%NaF溶液、蒸馏水处理大鼠口腔。具体方法为左手抓住大鼠颈部成仰卧位，右手用棉签分别蘸取上述溶液涂在大鼠口腔各个部位，包括前切牙、后磨牙、舌面、舌背，1 mL∕只，剩余的溶液用灌胃针注入大鼠口腔中，处理后3 h内禁食禁水，每天处理2次（上午9：00，下午8：00），连续5周，整个操作由同一人完成。每周称量1次大鼠体质量。在最后1周用10%水合氯醛腹腔注射处死大鼠，取上下颌骨，去除肉组织，用4 mg∕mL紫脲酸铵染色液染色36 h，洗净，用超薄金刚磨砂片沿牙远近中心向矢状半切，清洗干净，干燥。

2.5 Keyes法评价龋损目前体内牙齿评分均用Keyes评分法〔5〕，在体视显微镜下对大鼠磨牙光滑面龋、窝沟面龋进行分类计分，龋损程度分为E、Ds、Dm、Dx四级，依次代表釉质龋，牙本质浅层龋、中层龋、深层龋。

2.6 扫描电镜观察大鼠切牙将大鼠切牙沿牙远近中心向矢状半切，用扫描电镜观察致密度。

2.7 统计学分析数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以（xˉ±s）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠基本情况在实验过程中，观察大鼠的毛发、呼吸、饮食基本正常，行为灵活，体质量逐渐增加，统计分析紫地榆不同提取物组、NaF组、蒸馏水组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠体质量变化（±s,n=10，g）

表1 各组大鼠体质量变化（±s,n=10，g）

注：组间比较P＞0.05，差异无统计学意义。

组别乙酸乙酯提取物组给药前245.65±22.10给药1周247.29±26.43给药2周253.72±26.49给药3周252.41±27.10给药4周248.88±26.27给药5周267.34±32.06正丁醇提取物组NaF组249.58±20.96 242.96±26.33 250.50±25.68 246.56±26.97 259.79±25.41 254.00±28.29 254.73±26.76 255.30±30.49 248.80±26.33 264.52±45.29 257.61±27.67 260.00±31.47 250.06±54.67空白组245.09±36.21257.33±39.16250.76±18.39256.91±49.64244.51±51.55

3.2 光滑面Keyes记分大鼠牙光滑面龋损只观察到E级、Ds级，Dm、Dx级均未观察到。E级龋损、Ds级龋损中紫地榆不同提取物组与蒸馏水组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。但紫地榆不同提取物组与NaF组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；紫地榆不同提取物组间比较，差异均没有统计学意义（P＞0.05）。且NaF组未观察到Ds级龋损。见表2。

表2 光滑面Keyes记分（xˉ±s,n=10）

3.3 窝沟面Keyes记分E级龋损中，与蒸馏水组比较，各组差异均有统计学意义（P＜0.05），同时，紫地榆乙酸乙酯提取物组与NaF组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；但正丁醇提取物组与NaF组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Ds、Dm、Dx级龋损中，各组与蒸馏水组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05），但与NaF组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；紫地榆不同提取物组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。NaF组中未检测到Dm、Dx级龋损，乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组未检测到Dx级龋损，只有蒸馏水组中检测到E、Ds、Dm、Dx级龋损。见表3。

表3 窝沟龋Keyes记分（xˉ±s,n=10）

3.4 扫描电镜观察紫地榆乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组表面裂缝明显比蒸馏水组、NaF组少，正丁醇组比乙酸乙酯提取物组更致密，因此有更好的再矿化作用。见图1。

图1 大鼠切牙扫描电镜图（×5 000）

4 讨论

Keyes记分由P.H.Keyes在1958年提出，是目前应用最广泛的评分方法。E级记分反应龋损的广度，Ds、Dm、Dx级龋损反应龋损的深度，Ds级龋损为牙釉质和1∕4牙本质，Dm级龋损为1∕4～3∕4牙本质，Dx级龋损大于等于3∕4牙本质，Dx级龋损最严重。当相邻的数值间有轻微重叠时，在不相邻的数值间可以有忽略不计的重叠部分，因为生物差异的意义远远超过重叠部分。虽然都是人为评分，但实验数据的意义远远超过人为的误差。

在本实验中，与蒸馏水组相比，紫地榆不同提取物组的龋损分数明显更低，无论是光滑面还是窝沟各级评分都更低，差异有统计学意义（P＜0.05），但与NaF组相比，除了乙酸乙酯提取物组在窝沟E级龋损中差异有统计学意义（P＜0.05）外，其他各级差异均无统计学意义（P＞0.05）。且紫地榆乙酸乙酯提取物组和正丁醇提取物组无最深的牙本质深层龋，牙本质中层龋分较低，因此，紫地榆乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物有防龋效果，评分比蒸馏水高，比NaF组低。扫描电镜结果显示，紫地榆乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物组比蒸馏水、NaF组表面更致密，裂缝更少，再矿化效果更好。

目前常用防龋的物质主要为氟化物，但存在一定的弊端，如出现氟斑牙等，且吞咽不利于儿童的发展〔7〕。天然药物以其无毒副作用等优势越来越受到大众青睐，而研究发现，天然防龋药物的成分虽然复杂，但主要成分为鞣质〔8-11〕。紫地榆的主要成分为鞣质类成分，因此猜测紫地榆中有防龋作用的为鞣质类成分，但需要进一步研究。