金沙江木生淡水丝孢菌资源调查

李文丽，沈洪苇，章艳玫，阮清雄，周期山，苏鸿雁*

（1.大理大学基础医学院，云南大理 671000；2.大理大学农学与生物科学学院，云南大理 671003）

木生淡水丝孢菌（lignicolous freshwater hyphomycetes）是一类生态复合群，主要寄生在纤维素含量较高的木质基质上，其生活史的完成需要依赖淡水环境〔1〕。木生淡水丝孢菌是水环境中重要的微生物组分，发挥着重要的生态功能〔2〕。在生态系统的物质循环中，木生淡水丝孢菌能将有机物分解成可被原生动物吸收利用的营养物质和碳源，促进水体碳循环〔3〕。其次，淡水真菌能合成多种新型化合物，有报道证明一些具有活性的次生代谢产物，对肿瘤、细菌、真菌、线虫等有显著的杀伤作用，因此淡水真菌在农业和医药开发、环境治理等领域具有潜在的研究及应用价值〔4〕。也有部分淡水真菌是淡水动植物的病原菌，能引起淡水动植物的真菌病〔4-7〕。

研究表明海拔对水生丝孢菌〔8〕、菌根菌〔9〕、溪流里的木生真菌〔10〕、土壤真菌〔11〕等微生物的群落结构和物种多样性有影响。Geml等〔11〕研究了阿根廷安第斯山脉土壤真菌沿海拔梯度的变化并认为真菌群落的物种组成和海拔高度密切相关。Baerlocher等〔12〕对澳大利亚沉水叶片中的水生丝孢菌进行研究时发现真菌群落相似性和海拔梯度相关。Gómez-Hernández等〔13〕对沿海拔分布的外生菌根菌群落结构进行了研究，结果表明物种丰富度最高的是在中高海拔段。Shearer等〔14〕对秘鲁安第斯山水生子囊菌沿海拔梯度（218～3 870 m）分布的研究中，发现在低海拔（300 m以下）、中海拔（300～1 000 m）、高海拔（1 000 m以上）形成3个类群，中海拔水生子囊菌的多样性最高，低海拔次之，高海拔最低。Bahram等〔15〕对伊朗北部森林中外生菌根菌研究表明，物种多样性随海拔高度增加而降低，认为这可能是由于随着海拔升高植被多样性降低的缘故。Rahbek〔16〕研究也表明水生真菌的丰富度最高是在中高海拔段。Shearer等〔14〕认为由于研究区域的局限，不同海拔物种多样性不同与海拔、植被（宿主）是否相关还不是很清楚，物种多样性在中高海拔段最高还不能下结论。

金沙江地处滇西北三江并流区，流域面积广，海拔高差显著，支流众多，气候湿热，降水充沛，植被覆盖率高。金沙江良好的气候条件及多样的植被类型造就了该区丰富的物种多样性。淡水真菌作为水体微生态系统的重要组成部分，目前尚未有金沙江淡水真菌方面的相关研究。本项目采集金沙江不同海拔、不同河段的腐木进行木生淡水真菌多样性研究，了解该地区淡水真菌资源、多样性特征及群落组成，为金沙江木生淡水真菌的保护与利用提供本底资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集将金沙江（石鼓镇-白马雪山段，海拔：1 814～3 034 m）分为10个采样点，采集腐烂程度高（指掐木质松软为宜），直径1～2 cm，长10～15 cm的沉水腐木。每个采样点采集20根样品，共采集200根腐木，用自封袋装好后带回实验室，并记录采样地的地理信息、温度以及水体pH。见表1。

表1 样点地理信息

1.2 样品培养根据采样点的先后顺序对样品进行编号，准备20 cm×15 cm大小的不完全封闭塑料盒，用75%的酒精喷洒消毒，在盒底垫吸水纸，用无菌水浸湿，并放置2～3根塑料吸管，将样品放在吸管上，避免腐木与湿纸发生黏连，盖上盖子，在盒盖上标明采集地点、日期、采集人等相关信息。室温培养1～2周后开始检测样品，检测期间根据样品干湿度，可适量加无菌水，保持样本湿润。

1.3 形态观察保湿培养1周后，在GL-99BI连续变倍体视镜下观察菌落在自然基质上的着生方式及外部形态，并用大头针在目标菌株附近做好标记。用接种针将腐木上的菌株挑出，做成水封片后在OLYMPUS BX51生物显微镜下观察并拍取能反映菌体形态、孢子梗形态、产孢结构、分生孢子等形态的照片并作相应记录。

1.4 培养基的配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯100 g（去皮），葡萄糖粉10 g，琼脂条8.5g，去离子水加至500mL。

水-琼脂培养基（WA）：琼脂条8.5 g，去离子水加至500 mL。

麦芽浸粉琼脂培养基（MEA）：麦芽浸粉7.5 g，琼脂条8.5 g，去离子水500 mL。

MEA斜面的配制：称取麦芽浸粉7.5 g，琼脂粉8.0g，加去离子水500mL煮沸，每支保种管浸注1.5mL，121℃高压灭菌20 min取出，平置于超净工作台上，冷却后即可制成斜面。

以上培养基均经高压灭菌锅121℃高温高压20 min，冷却至50℃后加入氨苄青霉素（终浓度为100 ug∕mL）混匀，倒入平板凝固后方可使用。

1.5 菌种的分离纯化观察到目标菌株后，用无菌牙签蘸取少量培养基，轻轻将分生孢子分离下来，采用划线法，以便孢子分散在PDA培养基表面，并在培养皿上标明菌株编号及接种日期。室温培养12～24 h，将萌发的孢子转接到新的PDA或MEA培养基上，用封口膜封口并定期检查菌落的生长情况。

1.6 菌种鉴定基于形态学及分子生物学方法对获得的菌株分类鉴定，参考Seifert等〔17〕、Ellis〔18〕、任守才〔19〕、张凯〔20〕、张仪东〔21〕、姜于兰〔22〕、马建〔23〕、黄悦华〔24〕有关丝孢菌分类文献，结合外形以及微观形态（包括分生孢子梗，产孢结构，产孢方式，孢子的形状、大小、颜色、分隔、真或假隔膜，有无胶质鞘或附属丝等特征）对菌株进行初步分类。同时，刮取已获得纯培养的菌株菌丝，提取基因组DNA，测序后，将序列提交到NCBI网站上进行比对，进一步确定物种的分类地位。

1.7 菌种保存从培养基中刮取少量新鲜菌丝转接到MEA斜面上，室温培养至菌丝覆盖整个斜面后，放入4℃冰箱保存，所有操作均在无菌环境中进行。该方法在保存过程中易出现培养基水分丧失、菌体失活，因此每隔半年须重新转接，只适合短期保存。

1.8 干保本制作在体视镜下找到目标菌，将生长有子实体的木块用小刀切割下来，切割面积约为3 cm×3 cm。将切割下来的小木块放在信封纸上晾干，晾干后装入信封中，并在封口上注明编号及保存日期，在阴凉干燥处进行长期保存。

1.9 数据分析淡水丝孢菌出现频率（%）=（某个种出现次数∕样品总数）×100%。

采用香农-维纳指数（Shannon-Wiener index）分析金沙江淡水丝孢菌的多样性〔25〕。香农-维纳指数为：

其中，H′是群落多样性指数，Ni是第i种真菌的数量，N是所有真菌的数量，Pi是第i种真菌的数量占所有真菌数量的比例，S为所有真菌的种数。

2 实验结果

检测得到55株木生淡水丝孢菌，基于形态学及分子生物学方法对木生淡水丝孢菌进行鉴定，共鉴定出木生淡水丝孢菌23属37种，出现频率相对较高的属为Minimelanolocus（4.5%），其次为Stachybotrys（2.5%）和Bactrodesmium（2.5%）。见表2。采用H′计算得出金沙江木生淡水丝孢菌多样性指数是3.48，同时计算得出金沙江海拔1 800～1 900 m、1 900～2 000 m、2 000～3 000 m以及3 000 m以上的木生淡水丝孢菌多样性指数依次为2.07、2.01、1.57、1.50。见表3。

表2 金沙江淡水丝孢菌属级出现频率

续表2

表3 各海拔段淡水丝孢菌多样性分布

3 讨论

滇西北地区是世界上宝贵的物种基因库，此区气候湿热，降水充沛，植被类型多样，具有良好的物候条件。金沙江地处滇西北三江并流地区，流域内良好的气候条件及多样的植被类型孕育了该区丰富的物种资源。此次通过对金沙江（石鼓镇-白马雪山段，海拔：1 814～3 034 m）的200份腐木样本进行检测，共发现23属37种，其中出现频率最高的物种为Minimelanolocus（4.5%），其次为Stachybotrys（2.5%）和Bactrodesmium（2.5%），多样性指数为3.48，表明金沙江淡水丝孢菌资源丰富且多样性高，这与Shearer等〔26〕预测我国蕴含着丰富的淡水丝孢菌资源的结论一致。Shearer等〔14〕研究了低海拔（300 m以下）、中海拔（300～1 000 m）以及高海拔（1 000 m以上）的淡水真菌多样性，得出中海拔段的淡水真菌多样性最高，低海拔段次之，高海拔段最低的结论。本次研究对比1 800～1 900 m、1 900～2 000 m、2 000～3 000 m以及3 000 m以上各个高海拔段木生淡水丝孢菌丰度，发现随着海拔梯度的升高，木生淡水丝孢菌的多样性逐渐降低。由于样品采集地的水温及水pH并没有随海拔的升高而出现规律性变化，因此在本研究中温度和pH没有成为影响木生淡水丝孢菌多样性分布格局的主要因素。高海拔段木生淡水丝孢菌多样性逐渐降低的原因可能是：①随着海拔的升高，植被的覆盖率降低，落入水中的基质减少，淡水丝孢菌缺乏合适的着生基质；②高海拔地区的树种为抵制严寒，表皮往往会形成一层蜡质，不利于淡水丝孢菌的附着。