外泌体在帕金森病中的研究进展

孔凡丛， 吕占云综述， 杨 燕审校

帕金森病(Parkinson disease，PD)是发病率仅次于阿尔茨海默病的第二大的神经退行性疾病，其病因和发病机制目前尚不明确，临床主要表现为静止性震颤、肌强直、行动迟缓和姿势平衡障碍等运动症状。而外泌体广泛存在于脑脊液和外周体液中，拥有细胞间信号传导和病原体的转移以及细胞碎片的清除等生理功能，且在PD发展过程中其内容物发生改变。正是由于外泌体独特的生理功能以及在PD的发病、发展及治疗中所起到的作用而广受关注[1]。本文就外泌体在PD中的相关研究进展综述如下。

1 外泌体

细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)包含从细胞释放的各种膜限制性囊泡(membrane-limited vesicles)。根据这些囊泡的来源或大小，大致分为三类：凋亡小体，微泡(MV)和外泌体[1，2]。其中外泌体是来自内体系统(endosomal system)的最小和最具特征化的囊泡。外泌体是多泡体(multivesicular bodies，MVBs)与质膜融合后形成的直径为30～100 nm、密度范围为1.13～1.19 g/ml之间并释放到细胞外的膜性微囊泡，在电镜下呈双凹碟形或杯状[2，3]。外泌体可以将多种特异性蛋白质、脂质、mRNA、微小RNA和双链DNA等特殊物质在不同类型的细胞内传递到邻近或远距离的靶细胞，然后释放所运载的物质，最后识别并作用于相应的靶细胞。另外，外泌体调控许多重要的细胞生理活动，在免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应等过程中的作用均有相关报道，它既能成为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗[2]。同样，在PD中外泌体可以介导神经元和神经胶质的交流，既可以促进神经元的修复和生长，也能促进PD等神经退行性疾病的发展[4，5]。

2 外泌体在PD中的作用

2.1 α-突触核蛋白与外泌体在PD中的作用 虽然PD的病理特征需进一步研究，但目前研究表明PD患者脑中特异性蛋白质即具有多巴胺能神经毒性的α-突触核蛋白的聚集是其病理特征之一。α-突触核蛋白是路易体的组成成分之一，它是被外泌体包裹的突触前神经元蛋白[5]。α-突触核蛋白从结构上看是由140个氨基酸和3个区域组成，3个区域从功能上看，N-末端形成的α-螺旋在磷脂囊泡的结合中起作用，C-末端区域具有伴侣分子样功能，“非Aβ组”在聚集过程中起重要的作用[6]。由于α-突触核蛋白是路易体中异常蛋白质沉积的主要成分，在PD发生发展过程中起着主要而肯定的作用[5]，且研究表明α-突触核蛋白参与外泌体的运输活动，因此越来越多的研究关注α-突触核蛋白与外泌体在PD中的作用。

起初，相关研究表明α-突触核蛋白仅在细胞内发挥其致病作用，但这一观念被El-Agnaf等[7]打破，因为他们在人类血浆和脑脊液中发现包含α-突触核蛋白的外泌体可以在脑内扩散。Emmanouilidou等[8]通过SH-SY5Y细胞证明α-突触核蛋白通过外泌体输出，去影响邻近神经元的生存能力以促PD发展。相关研究发现这一过程可以进一步诱导外泌体的形成、加速α-突触核蛋白在脑内的蓄积[9]，这与最近从PD患者的脑脊液中分离出外泌体的研究结果相符。此外，Stuendl等[10]发现外泌体α-突触核蛋白水平与认知障碍的严重程度有关，这从某种程度上证实临床上部分PD患者发病后的几年内出现认知功能的下降。α-突触核蛋白通过外泌体输出，这一观点被Alvarez-Erviti等[11]进一步证明。他们发现SHSY5Y细胞过表达的外泌体中含有α-突触核蛋白，这些外泌体可以有效将α-突触核蛋白转移至正常的SHSY5Y细胞，而且这些含有α-突触核蛋白的外泌体抑制PD脑中溶酶体功能。从而导致外泌体中α-突触核蛋白释放增加，而这些蛋白向受体细胞扩散范围增加。Danzer等[12]试图寻找外泌体相关的α-突触核蛋白的特点。有研究发现在PD患者脑脊液中的外泌体以剂量依赖性方式诱导α-突触核蛋白的寡聚化，在鉴定外泌体的α-突触核蛋白寡聚体的过程中发现这些外泌体中α-突触核蛋白寡聚体对邻近细胞的毒性比不含外泌体的α-突触核蛋白寡聚体更大。此外，还有其他相关研究支持外泌体在PD中的神经毒性作用。Chang等[13]发现α-突触核蛋白可以决定小胶质细胞的外泌体分泌量，此外，活化的外泌体可以增加细胞凋亡，这支持了外泌体可能介导神经变性的假说。

上述研究都进一步证明聚集的α-突触核蛋白可以在神经元之间传播的理论，该理论可以阐述PD逐渐发展的机制。由此表明α-突触核蛋白表达的降低可以延迟或阻止PD进展，并且通过外泌体降低α-突触核蛋白表达来延缓或阻止PD的发展可以给PD带来新的诊治思路[11]。

2.2 Micro RNAs(miRNAs)与外泌体在PD中的作用 Micro RNAs(miRNAs)是一类在进化上高度保守的非编码RNA，在基因的转录翻译、细胞生长、组织分化和细胞凋亡、遗传和表观遗传等生命活动中发挥重要调控作用，与肿瘤的发生、神经系统疾病、心血管疾病等有着千丝万缕的关系。单个miRNA可以调控数百个目标基因的表达，因此一组miRNAs的改变可能会极大地影响PD的病理生理学和结局[14]。

有相关研究发现miR-205的上调能抑制PD患者脑组织中LRRK2蛋白的异常上调[15]。miR-34b/c在PD患者脑组织表达下调，并且进一步研究发现miR-34b/c的早期下调会触发下游转录组改变，这些改变导致线粒体功能障碍和氧化应激，最终影响细胞活性[16]。同样地，小胶质细胞中miR-7116-5p的下调促进了TNF-α的产生，然后TNF-α进一步刺激其他促炎因子的产生从而导致多巴胺能神经元损伤[17]。另外，miR-135a-5p的下调与ROCK2上调启动多巴胺能神经元的吞噬功能[18]。对此，相关研究证实miR-135a-5p 激动剂可能保护多巴胺能神经元免受吞噬作用[18]。Kim等[19]发现 miR-133b在中脑多巴胺能神经元特异性表达，并可调控中脑多巴胺能神经元的成熟和功能，但PD患者的中脑组织缺乏该miRNA。Doxakis等[20]发现 miR-7和miR-153能与α-突触核蛋白mRNA的3’非编码区特异结合，下调该mRNA和α-突触核蛋白的水平。Li等[21]发现外泌体MiR-221通过靶向作用PTEN来调节PC12细胞活力和凋亡，从而在PD中起保护作用。然而，上述与PD有关的特异性miRNA功能的实现需要借助外泌体的转运功能。通过外泌体将这些miRNAs包裹，使其免受防御系统的识别、攻击而产生的一系列免疫反应，使其保证结构和功能的完整性，从而干预PD发生、发展[14，22]。

包含miRNAs的外泌体作为PD的诊断性生物标志物，可以在疾病的最早阶段进行检测并进行治疗，以延迟发病或延长疾病发展到晚期阶段的时间[14]。然而，也有研究表明其他器官的细胞也会分泌包含miRNA的外泌体并释放到血液中，因此循环水平的miRNA可能无法准确反映病变大脑本身特定miRNA的水平[23]，这也是外泌体相关研究的难点和重点。

2.3 基因与外泌体在PD中的作用 许多与PD相关的基因(包括LRRK2、VPS35和PARK9)在自噬和内吞途径中发挥重要的作用，并且有研究表明PD相关基因与外泌体发生和释放相关。例如：LRRK2蛋白参与蛋白质的分选、运输、自噬，以及外泌体的结合、释放[24，25]，VPS35参与外泌体的内体运输[26]，在外泌体中发现PARK9蛋白是P型转运ATP酶[27]，调节外泌体合成。此外，PARK9过表达减少了SH-SY5Ys细胞内的α-syn水平，并增加了外泌体中的α-syn外显化[28]。相反，PD患者的成纤维细胞失去PARK9调控后，多囊泡体中的腔内囊泡数目减少，并且外泌体释放到靶细胞的数量减少[29]。尽管有不少基因调控外泌体的发生、发展及功能应用，但具体的调控机制仍需要进一步研究，以便将研究应用到临床中。

3 外泌体的应用前景

外泌体拥有广阔的应用前景，原因在于其不仅拥有稳定性、低免疫原性等特点，而且运输功能更为强大；可以运载具有治疗作用的siRNA(silencingRNA)、miRNA甚至是药物，还可以运载具有神经毒性的α-突触核蛋白。除此之外，最重要的一点是它可以穿过血脑屏障，将运载物送达靶细胞[30]。

Shi等[31]研究发现即使脑脊液中外泌体α-突触核蛋白被认为是PD的生物标志物，与对照相比，PD患者脑脊液中外泌体α-突触核蛋白的含量较低，PD患者的血浆中外泌体α-突触核蛋白的含量更高。该研究还发现这些血浆中α-突触核蛋白在PD与对照者中的含量在灵敏度和特异性方面与CSFα-突触核蛋白接近，血浆外泌体α-突触核蛋白与疾病严重程度之间有显著相关性。目前与α-突触核蛋白有关的研究也支持含有α-突触核蛋白的外泌体对PD的诊断治疗具有一定的作用[32]。因此，阻止包含α-突触核蛋白的外泌体释放和摄取是有关PD的一种新型诊疗思路。

近期研究报道，与正常对照者相比，从PD患者的血细胞、血浆、血清和脑脊液外泌体中也可检测到差异表达的miRNA，并且一些差异表达的miRNA 有助于PD的诊断。并且，结合的miRNA具有来源丰富、组织特异和高度稳定的特点，因此miRNA被认为是适合作为PD 的生物标志物[33]。

外泌体不仅可以用于诊断还能用于治疗。有相关研究发现血液外泌体可以穿过血脑屏障成功地将多巴胺送至纹状体、黑质，且在脑内分布浓度可高达15倍。并且该研究还发现包裹多巴胺的外泌体的靶向治疗不仅效果优于静脉内注射游离的多巴胺，而且对神经毒害作用更低[34]。

尽管外泌体有着广泛用途，但外泌体也具有传播如朊病毒样蛋白质[35]和病理性炎症[36]等不利方面，所以外泌体在PD中的应用依然还要走很长的一段路。

4 小结与展望

虽然外泌体有很广阔的应用前景，但是我们还有许多的问题亟待解决，例如：神经元细胞如何识别不同的外泌体，外泌体包裹的物质如何被识别、卸载、利用，外泌体是如何穿过血脑屏障、如何逃避免疫反应以及外泌体如何选择需要运载的物质、同一细胞又会分泌多少种不同的外泌体。此外，用外泌体诊断治疗PD对我们来说是一种新型的诊疗思路，这其中还有许多问题有待进一步探讨。