建设具有中医儿科学科特色的儿童肺系病症生物样本库的思考

张秀英， 王雪峰， 仇明珂

辽宁中医药大学附属医院儿科成立于1958年，2002年获批国家中医药管理局重点学科、重点专科，三级科研实验室-病毒实验室，2008年被评为国家中医药管理局重点专科组长单位、国家中医临床研究基地妇儿病研究基地及小儿肺炎毒热证重点研究室。中医药防治小儿肺系病症是本学科的主要研究方向。学科带头人王雪峰教授先后主持承担了“十五”国家科技部攻关项目-小儿肺炎中医证治规律研究(2001BA701A16a)及以小儿肺炎为示范建立辨证规范及中医疗效评价方法体系研究(2004BA721a05)，“十一五”国家科技支撑项目-中西医结合综合方案干预小儿肺炎疗效评价研究(JDZX2012098)和“十二五”行业专项-儿童群体社区获得性肺炎中医综合防治方案推广应用研究(201307007)等系列临床科研项目。基础研究方面该学科主要致力于探索中医药干预肺炎支原体、流感病毒、呼吸道合胞病毒肺炎等。同时针对儿科临床特点也对慢性咳嗽、反复呼吸道感染及哮喘等病种开展系列研究，在小儿肺系病症临床及科学研究方面奠定了夯实的基础。为了进一步满足临床与科学研究的需要，深入研究儿童肺系疾病的发病机制，探讨有效的预警、早期诊断和临床治疗方案以降低发病率和病死率，因此提出了构建具有学科特色儿童肺系病症生物样本库的构想，以其进一步深化学科的内涵建设。

1 生物样本库的建设现状

生物样本库又称生物银行(Biobank)，主要是指收集和应用健康及疾病生物体的生物分子、细胞、组织和器官等，包括人体器官、组织、体液或处理过的样本(DNA、RNA、蛋白等)及其与这些样本相关的临床资料、质控、管理等生物应用系统[1]。一般由两部分组成：一是样本实体库，即可以从中提取到DNA、RNA、蛋白质等成分的组织或血液等生物样本；二是样本信息库，包括从生物样本中提取DNA、RNA、蛋白质等成分所得到的个人独有的遗传信息数据及临床诊疗信息[2]。

美国从1987年开始就出现了专门的生物样本资源库，2001年欧洲生物样本库(Eurobiobank)建立，随后，英国、奥地利、澳大利亚等国家也相继建立了自己的生物样本资源库。亚洲地区的韩国、日本、新加坡均拥有自己的生物样本库网络。我国生物样本的收集开始于20世纪70年代。1994年由中国科学院建立了第一个中华民族永生细胞库。随后山东、北京、泰州、天津等也分别建立了相应的生物样本库。中医药行业领域，生物样本库起步相对较晚。2010年湖北省中医院在样本库建设方面做了初步的探索。经过近几年的发展，目前已具备一定的规模。

2 儿童肺系病症生物样本库建设要点

具有完整临床信息的高质量的规范的生物样本是样本库建设的核心内容[3]。高质量的样本对于深入研究疾病以完善诊疗非常关键，而科学研究所得到的数据是否可靠则有赖于样本在采集、处理及存储等各阶段严格的质量控制[4-5]。主要包括一次样本血液和组织样本采集和处理，二次样本的质量控制及信息样本的完整性等方面[6-7]。

2.1 规范一次样本采集及处理 一次样本的采集过程应严格执行样本库相关标准作业程序。血液样本从采集到入库的整个过程在2 h内完成。用抗凝管和促凝管分别采集血液各1管，然后由专门的工作人员在最短的时间内送至样本库，室温放置30 min后，2 500g15 min离心，多管分装(4小管，2大管)，短期存放的样本保存在-80 ℃冰箱，长期或者重要的样本存放在液氮中，整个血样处理过程在生物安全柜中完成。组织样本在整个切取、转运、入库过程都在低温下进行，组织样本从热缺血到完成分装、入库的整个过程，时间控制在30 min内。组织样本切除后，用无菌、无RNA酶的生理盐水冲洗样本，去除样本上的黏液、血液。为了避免交叉污染，应使用消毒灭菌后的器材。转运时需置于碎冰上，然后速冻在液氮中。

2.2 定期对二次样本进行质检 对样本进行抽检是保证DNA/RNA及蛋白质完整性的重要手段。应采用随机原则，以一定的比例，按照等距原则进行随机抽样。每月随机抽取2%的样本，每年年初抽取0.1%的样本进行质量检测。DNA/RNA主要检测DNA/RNA的浓度、纯度及完整性。提取样本中的DNA/RNA，然后用分光光度法检测DNA/RNA的浓度和纯度，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA/RNA的完整性。蛋白质质量检测可选择特定的抗体，用Western Blot和酶联免疫吸附剂测定技术检测样本中蛋白的相应抗原或结合蛋白质谱分析来评估蛋白质的质量。肺组织样本的质量检测主要采用苏木精和伊红染色方法评估。

2.3 实现管理体系制度化 首先建立数据库管理制度，构建科学合理的、高效的、易于维护的、专业化的样本库数据管理系统，利用信息化技术实现样本信息(患者资料、标本资料、随访信息、反馈信息等)及样本资源的完善保存与管理。其次制定生物样本库管理制度、仪器设备使用管理制度、样本库相关试剂管理制度及废液废物处置等制度，统一管理规范，从样本的入库到出库每个环节均有相应的规章制度，保证其有章可循。同时制定一套样本质量评估体系如定期随机抽检机制度等。再次依据存储样本的生物安全防护等级确立相应生物安全管理制度。同时应有消防安全、物理安全、化学安全、信息安全及危险品管理等相关制度。最后制定实验室紧急疏散预案；水电事故应急处理预案；火灾及液氮冻伤等应急预案。

2.4 实时监测存储条件 样本存储条件的稳定是样本质量的基本保障。样本库应配备自动化温控监测系统对室温、低温冰箱、超低温冰箱、液氮罐进行24 h持续监控，监测频率应为30 min 1次;如监测参数有异常，系统将自动报警并发送短信通知样本库工作人员，工作人员在1 h内到达，现场处理并填写意外。

2.5 保证信息的完整性 肺系病症生物样本库的信息包含了基本临床信息、随访信息、出入库使用情况及课题应用反馈数据。样本库的基本临床信息包括样本对应的患者各项生化检查、影像资料及治疗情况;随访信息包括患者的疾病复发情况及预后等。完整的信息资料可为评估临床治疗方案提供最终标准，有助于诊疗方案的完善和改进;同时也是课题具备临床意义的重要证据。

3 建设具有学科特色肺系病症生物样本库的意义

生物样本库是众多重要科研成果快速产业化、应用到临床、实现转化医学的重要保证。高质量、标准化的生物样本库是疾病基础与临床研究、临床诊治技术研发、药物研发、健康研究与产业化，即实现转化医学的最宝贵资源[8]。利用生物样本进行生命科学研究、进而服务于临床诊疗是生物样本库建设的最终目的[9-10]。依托儿童肺系疾病生物样本库信息样本、一次样本及二次样本结合蛋白组学、基因组学及代谢组学探讨肺系疾病相关中医证候的微观生物标志物，从微观层面揭示肺系疾病相关中医证候的本质特征。

通过采集和存储的具有学科特色的儿童肺系病症的生物样本可支持相关病症的国家和省市级课题的立项，完成学科的人才培养及梯队建设。其研究结果可发表相关论文及专著，有利于学科开展广泛的学术交流，提高学科学术建设水平。同时通过跨学科协作，如临床医学、生物化学、细胞生物学、分子生物学、病理学、生理学、药理学、免疫学和伦理学等多学科的协作，可更好地推动基础和临床研究的发展，深化学科建设内涵，继续保持本学科在国内中医儿科领域的优势地位。