半胱氨酸组织蛋白酶与动脉粥样硬化心血管疾病的关系

刘亚坤，胡盼盼，罗善顺

动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是一种以广泛的动脉壁基质蛋白降解为特征的炎症性疾病，持续的炎症和重塑过程将最终破坏动脉壁。来自人类组织和临床前动物模型已经明确了半胱氨酸组织蛋白酶在细胞外基质（ECM）的重塑与动脉粥样硬化性心血管病变的发展密切相关。本文综述了近年来这一领域的研究进展，着重介绍半胱氨酸组织蛋白酶参与几种心脏和血管疾病的发病机制以及ASCVD发展的预测。

1 溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶的结构、功能与调控

人类组织蛋白酶共有11种（B，C，F，H，K，L，O，S，V，W和X）。其中大多是内切肽酶（如F，K，L，S，V），组织蛋白酶C和X、Z则是严格的外切肽酶。其次，组织蛋白酶与木瓜蛋白酶家族同源性较高。组织蛋白酶活性受stefins（A和B）和胞外Cystatins（CystatinC或Cyst C）和激肽原调控。组织蛋白酶通过它们的结合作用降解大多数细胞蛋白。心血管及其相关细胞表达不同的组织蛋白酶。

2 组织蛋白酶在动脉粥样硬化心血管疾病中的作用

动脉粥样硬化是一种炎症性疾病，与心血管疾病相关的炎性细胞可以表达高水平的组织蛋白酶。这些蛋白酶中，基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶被认为有助于细胞外基质蛋白的降解，然而，基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的抑制已被发现在人和动物的心血管重构模型中的不完全抑制，表明其他蛋白酶也可能参与了CVD的发病机制[1]。

2.1 组织蛋白酶S组织蛋白酶S能引起血管炎症和钙化，因其产生活性弹性蛋白肽[2]。组织蛋白酶S缺乏（Cat S-/-）的小鼠可降低其弹性蛋白酶活性和断裂次数，此外小鼠的空斑巨噬细胞、平滑肌细胞也明显降低。来自Cat S-/-小鼠的巨噬细胞通过一种由单层内皮细胞和Ⅰ型、Ⅳ型胶原组成的人造主动脉壁转运能力减弱。另一项在使用缺乏载脂蛋白E（ApoE-/-）小鼠Cat S-/-的研究中，12周西式饮食后，小鼠动脉粥样硬化斑块面积和斑块破裂数分别减少了46%和73%。此外组织蛋白酶S作为自身机制，促进炎症反应。由于慢性炎症和磷酸钙血清水平的持续失衡，慢性肾病（CKD）患者面临着一个有害的反馈回路。因此，对CKD患者进行动脉粥样硬化提前干预非常关键。组织蛋白酶S的抑制作用作为提前干预，减少斑块形成和减少CVD的影响已被突出，尤其是CKD患者。研究者认为，未来在易钙化个体中的干预应针对炎症和磷酸盐失衡，以减少与弹性蛋白降解和钙化有关的负反馈回路的影响[2]。另外，Chen等在含有E64d（一种组织蛋白酶S抑制剂）的小鼠模型中，发现Cat S在心肌梗死（MI）中参与了转化生长因子-β1的信号转导、成纤维细胞的分化、细胞外基质的产生和调节[2]。此外，Shi等发现在缺乏组织蛋白酶S的小鼠模型中，在创伤修复过程中，当组织蛋白酶S活性被抑制时，微血管形成减少。Sasaki等研究了解到血管紧张素Ⅱ是血管内稳态中的一员，因此阐明了奥美沙坦有助于维持斑块的稳定性，抑制组织蛋白酶S的活性，使用奥美沙坦作为治疗干预措施，以减少心血管疾病的后果[2]。在腹主动脉瘤（AAA）中，Qin等在小鼠模型中，为组织蛋白酶S在AAA形成中的作用提供证据，并建议把抑制组织蛋白酶S作为预防人类AAA的治疗靶点。Lv等研究表明血浆组织蛋白酶S、胱抑素C、主动脉内径与最低踝臂指数相关.这些参数可作为评估动脉疾病和AAA的生物标志物，并强调更高级的AAA病例在AAA病变和循环中含有更高水平的组织蛋白酶S。研究还发现，Cat S在炎症和感染条件下时可在人牙周膜（PDL）细胞中表达，其通过刺激PDL细胞的增值和迁移，促进伤口愈合，这表明组织蛋白酶可能在牙周重塑和愈合中起重要作用。此外，Toll样受体2激动剂显著增强了创口闭合，这种刺激作用也依赖于组织蛋白酶[3]。

2.2 组织蛋白酶K组织蛋白酶K与组织蛋白酶S具有相同的染色体定位，难以检测到其在正常动脉中的表达[6]。我们发现组织蛋白酶K与胶原降解产物CTX-I在人源性动脉粥样硬化斑块中密切相关。体外研究进一步证实泡沫细胞衍生的组织蛋白酶K能积极降解Ⅰ型胶原蛋白[5]。此外，Lutgens表明，Cat K缺乏症（CatK-/-）会引起动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠的斑块面积减少，胶原蛋白增加，弹性蛋白断裂减少。Samokhin等发现，Cat K-/-通过保持中膜完整性和减少ApoE-/-小鼠斑块破裂的脆弱性来增加头臂动脉损伤的稳定性。这些结果突出了Cat K缺乏在动脉粥样硬化中的保护作用[1]。研究发现Cat K-/-抑制实体瘤的生长，肿瘤的血管生成、细胞增殖及胰岛的形成，而其内源性抑制剂Cyst C的缺失导致了相反表型。

2.3 组织蛋白酶LCat L是一种内溶酶体半胱氨酸蛋白酶的过度表达，与各种人类恶性肿瘤患者的低位生存相关。多变量分析显示，骨髓单核细胞（BMMC）中的Cat L可作为一个独立的预后指标，对总生存率有显著影响。因此，Cat L有预测儿童AML预后中的潜在应用价值[7]。Liu等发现Cat L在平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞中均有表达并且在动脉粥样硬化和腹主动脉瘤（AAAS）中表达增加。Kitamoto等指出，在Ldlr-/-小鼠中，Cat L基因的一个或两个等位基因的在第12周和26周的缺失都可缓解动脉粥样硬化病变。斑块脂质核心区，斑块炎性细胞和胶原含量，内侧平滑肌细胞含量，弹性蛋白断裂，所有这些都以基因剂量依赖的方式减少。Kitamoto等表明Cat L通过降解弹性蛋白和胶原蛋白，能促进动脉粥样硬化的发展，从而推动病情的发展[1]。此外，Shimada和他的同事证明了Cat L的药物和基因干预都将导致眼内新生血管的显著减少。对比于健康人，内皮祖细胞（EPCs）中的Cat L活性在2型糖尿病患者中显著降低。结果表明，内皮祖细胞中表达的Cat L在眼内血管生成中起着重要作用，提示人们在治疗新生血管性眼部周围动脉疾病时，Cat L可作为靶向治疗方法[4]。

2.4 组织蛋白酶CCat C是一种高度保守的四聚体溶酶体半胱氨酸二肽基氨基肽酶，其最佳生理功能是促炎性颗粒相关丝氨酸蛋白酶的激活[8]。丝氨酸蛋白酶酶原的激活是通过骨髓间充质干细胞在骨髓细胞成熟过程中通过N-末端二肽裂解而发生的。因此，在骨髓前体细胞中短暂地阻断Cat C活性可能是一种有吸引的治疗策略，用于调节炎症和免疫条件下丝氨酸蛋白酶的活性。各种Cat C抑制剂已经由制药公司和学术研究人员开发[8]，例如组织蛋白酶C抑制剂增强巴菲霉素引起的自噬阻滞以及在大肠癌细胞中，Cat C抑制剂诱导内质网应激和HCT-116细胞凋亡，以上研究表明，在自噬介导的结直肠癌细胞增殖的调控中，Cat C靶向起了关键作用。还需进一步研究来确定Cat C在其他肿瘤的功能性作用，可能对未来的癌症的治疗预防有意义[9]。Cat C的基因和蛋白在颈动脉破裂和晚期病变中的表达显著增加，并且由空斑巨噬细胞和泡沫细胞大量表达。小鼠骨髓移植导致的白细胞Cat C缺乏症（在Cat C-/-ldlr-/-小鼠嵌合体），早期和晚期板块中，斑块负荷在颈动脉、主动脉弓和根部以及降主动脉明显减少，提示Cat C缺乏可使动脉粥样硬化病变进展减慢[1]。

2.5 其他半胱氨酸组织蛋白酶动脉粥样硬化病变中还有其他组织蛋白酶的参与。例如在APOE-/-小鼠动脉粥样硬化病变中Cat B mRNA和蛋白水平升高，在巨噬细胞丰富或管腔旁，Cat B免疫反应性表达阳性率最高[6]。研究发现，在病毒性心肌炎（VMC）小鼠模型中，通过Cat B-/-基因消融可减少炎性细胞的浸润，肌钙蛋白水平的降低，改变心脏内病毒滴度，从而改善存活率，提示CatB可能通过激活炎症和促进下垂而加重CVB 3诱导的VMC，这为VMC的治疗提供了一种新的策略[11]。Cat F与正常动脉相比，在动脉粥样硬化中的巨噬细胞、平滑肌细胞及内皮细胞中比例明显增高。Cat V作为最有效的弹性蛋白酶，同样表达于动脉粥样硬化病变中，并以三分之一弹性蛋白酶活性占据巨噬细胞。这些组织蛋白酶大都直接参与人类动脉粥样硬化的发生[6]。

2.6 胱抑素C胱抑素C（Cyst C），作为重要的内源性抑制剂，降解溶酶体组织蛋白酶超家族中的组织蛋白酶，并且在动脉粥样硬化病变中的表达下降。这些发现表明，组织蛋白酶及其抑制剂Cyst C在心血管疾病中存在表达不平衡[1]。为了明确动脉粥样硬化中Cyst C的作用，我们选取了Cyst C和ApoE双缺陷小鼠（Cyst C-/-ApoE-/-小鼠），（Cyst C+/+ApoE+/+小鼠）作为对照组，在25周致动脉粥样硬化饮食后，结果显示，小鼠在缺乏胱抑素C的情况下，产生更大的瓣膜下斑块，这些结果提示在动脉粥样硬化病变中，Cyst C具有保护作用[1]。此外，研究还发现Cyst C在AAAS中表达的下降提示Cyst C可能在AAAS的发病机制中起一定作用。为了研究Cyst C在AAA中的直接作用，Sukhova等养殖了Cyst C-/-APoE-/-小鼠，Cyst C-/-APoE-/-小鼠与ApoE-/-对照小鼠相比，胸腹主动脉明显扩张。机械研究表明，Cyst C缺失显著增加了中膜弹性层的碎裂，降低了主动脉病变的内侧尺寸，增加病变的平滑肌细胞和胶原的含量。Cyst C缺失可使AAA的组织蛋白酶活性提高5.5倍，产生更大的弹性片层碎裂和原血管生成肽层粘连蛋白-5伽马-2，这可能是与ApoE-/-小鼠相比，Cyst C-/-ApoE-/-小鼠病变微血管增多的原因之一。Schulte得出结论是Cyst C缺乏症对实验性AAA形成的促进作用可能与半胱氨酸蛋白酶活性的增强有关[1]。

3 展望

ASCVD基础和临床研究中的许多数据强调了组织蛋白酶在这些疾病中的作用以及对动脉细胞外基质蛋白的降解，很明显，溶酶体半胱氨酸蛋白酶作为调节酶，超越了传统的简单家务蛋白酶的作用，在溶酶体之外具有重要的功能，发挥强的胶原溶解和弹性分解活性。动脉粥样硬化性心血管疾病（如动脉粥样硬化和腹主动脉瘤）中半胱氨酸蛋白酶含量的增加和内源性抑制剂Cyst C水平的降低提示动脉血管内基质降解的不平衡。增加血清中Cat L、Cat K和Cat S和降低内源性抑制剂Cyst C的水平可作为冠心病和动脉瘤患者的预测生物标志物。在动脉粥样硬化和AAA等心血管疾病的动物实验模型中，组织蛋白酶已成为药物和抑制剂的靶点。但是，关于这些抑制剂对人动脉粥样硬化性心血管疾病的作用及药理和生理安全性数据，仍需要大量临床研究来明确。