油菜品质性状分子标记开发及QTL定位研究进展

江建霞，张俊英，李延莉，蒋美艳，王伟荣，周熙荣，杨立勇，孙超才

(上海市农业科学院作物育种栽培研究所，上海201403)

油菜是我国食用植物油的主要来源之一。2015年农业部发布的《中国农业展望报告(2015—2024)》指出：我国食用植物油消费中，豆油、菜籽油、棕榈油和花生油分别约占44%、24%、16%和8%，预计2024年菜籽油消费所占比重将为25%。菜籽油不仅是人类重要的食用油，而且在工业中也有广泛应用，如作为原料制备润滑剂、生物柴油等，此外，菜籽饼富含蛋白质和氨基酸，是牲畜家禽饲料中的优质蛋白饲源。近几十年来，改良菜籽油的品质是科学家的主要育种目标。随着基因组测序和分子标记技术的广泛应用，分子标记辅助选择(MAS)技术的不断发展，油菜的油酸、亚油酸、亚麻酸、芥酸和硫苷等重要品质性状相关的分子标记和QTL定位的研究成果越来越多。本文重点阐述近些年来利用分子标记技术对油菜的含油量以及油酸、亚麻酸、芥酸和硫苷等性状进行遗传图谱构建、QTL定位和分子标记辅助育种的研究现状。

1 油菜高含油量的QTL定位和连锁分子标记的开发

目前，大田推广种植的大部分商业种油菜的含油量在40%—50%，距理论含油量还有一定距离，而油菜籽的含油量是决定油菜经济价值的主要因素，油菜含油量每提高1%相当于产量提高2.3%—2.5%，因此，提高油菜含油量是育种学家的重要育种目标[1]。

前人对油菜含油量进行了较多的研究，利用杂种优势提高甘蓝型油菜含油量是其中一个重要途径。Zhao等[2]利用德国品种‘Sollux’和中国品种‘Gaoyou’的杂交F1代培育的DH群体进行种子含油量相关QTLs定位，共获得6个QTL位点和9个上位效应位点，它们对种子含油量及蛋白含量具有多效性，进一步鉴定获得2个独立控制含油量而不影响蛋白含量的QTL位点。张宁[3]以欧洲双低油菜冬性品种‘Tapidor’和中国双高油菜半冬性栽培种‘Ningyou7’为亲本构建了TN DH系作图群体，通过对群体进行基因型和表型分析，绘制遗传图谱并在C2连锁群上发现了一个含油量QTL簇qcO.C2，并初步预测qcO.C2区间存在9个与油脂合成相关的候选基因。郭世星[4]利用加拿大引进品系CG38和人工合成甘蓝型油菜品系B25的杂交后代BC1为作图群体，采用SSR、RAPD和SRAP标记构建了一张包含20个连锁群的甘蓝型油菜遗传连锁图谱，并检测到2个含油量相关QTL位点，它们位于第10连锁群上的标记SSRRa2-EO和EM15ME14之间和第15连锁群上的标记EM5MEllb和EM12ME14间，分别解释4.43%和18.68%的表型变异。Wang等[5]将低含油量品种‘KenC-8’和高含油量品种‘N53-2’进行杂交产生F1，并通过F1代产生的DH系构建遗传连锁图谱，该DH群体被种植在8个自然环境中，通过含油量性状的表型分析和QTL定位，最终63个QTLs被鉴定得到，它们被进一步整合为24个一致性QTLs，其中5个QTLs来自于低含油量亲本‘KenC-8’，19个QTLs来自于高含油量亲本‘N53-2’。Teh等[6]利用两个冬性的双低油菜品种‘Sansibar’和‘Oase’的杂交F1代获得的DH系进行脂肪酸组成、蛋白含量和含油量等性状的QTL定位，最终得到含油量相关的5个微效QTL，命名为DE-Oil.1—DE-Oil.5，分别位于A01、A02、A07、C03-II、C08连锁群上，且分别解释了4.3%—6.7%的表型变异，共解释了27.5%的表型变异。对含油量相关微效QTL进行候选基因的预测，获得A01上的候选基因LPAAT(Bra037553)。Sun等[7]利用含油量约50%的高含油量品种‘zy036’和含油量约36%的低含油量品种‘51070’杂交获得F1代进而获得DH系，构建遗传连锁图，共包含527个分子标记。结合多年多点的田间数据，一共鉴定得到12个含油量性状相关的QTLs，其中9个高含油量的QTLs来自于高含油量品种‘zy036’。4个与种子含油量相关的候选基因(BnG44、BnG30、BnG40、BnG36)紧密连锁的标记分别为GSNP39、GSSR161、GIFLP106和GIFLP046。Raboanatahiry等[8]通过将多个群体的QTL图谱进行整合，对控制种子含油量和脂肪酸含量的基因和位点分布进行同线性分析，最后从57个重叠QTLs区间中鉴定得到61个与含油量有关的候选基因，通过网络互作和通路分析，KASI、KASII、LPAAT、GPAT等基因与其它基因互作程度最高，它们可能影响种子含油量。

2 与油菜高油酸低亚麻酸相关的分子标记

油菜中油酸和亚麻酸的含量对食用品质、营养品质、存储等方面有着重要的影响。首先，从食用品质方面考虑，高油酸含量的菜籽油中多不饱和脂肪酸含量相对较低，热稳定性强，能够满足如煎炸、糕点等食品加工行业的需要；其次，从营养品质方面考虑，菜籽油中油酸(C18∶1)等单不饱和脂肪酸更有益人体健康，而亚麻酸(C18∶3)含有三个不饱和键，极易氧化形成自由基，出现脂质过氧化反应，损伤细胞与细胞膜的结构和功能[9]，另一方面，α-亚麻酸(ALA)是EPA和DHA等的合成前体，而DHA和EPA对视网膜和神经发育以及免疫炎症反应起着至关重要的作用[10-11]；最后，从储存方面考虑，高油酸菜籽油在纯化加热过程中不容易被氧化，热稳定性好，而亚麻酸在高温或强光照条件下容易被氧化导致油脂变质，不利于储存。因此，综合考虑菜籽油中油酸和亚麻酸含量对人体健康和储存方面的影响，提高菜籽油中油酸含量，降低亚麻酸含量成为油菜品质育种中一个重要育种目标。

油菜种子中油酸和亚麻酸含量相关的分子标记的开发和利用尤为重要。Hu等[12]在一个甘蓝型油菜的DH群体中定位得到2个油酸含量有关的QTL位点，包括位于N5连锁群上的一个主效QTL位点(fad2基因)和位于N1连锁群上的一个微效QTL位点。同时，他们还定位得到2个亚麻酸含量有关的QTL位点，其中主效QTL被证实为N14连锁群上的fad3c基因，另一个主效QTL是N4连锁群上的fad3a基因。将EMS突变体与野生型品种中fad2和fad3c基因序列比较，发现两基因均发生单核苷酸突变，进而引起脂肪酸含量变化，根据突变体和野生型间fad2和fad3c的序列差异，设计的2个SNP标记在甘蓝型油菜高油酸低亚麻酸辅助选择育种中发挥重要作用。Javidfar等[13]获得了8个与油酸和亚麻酸含量相关联的RAPD标记，其中标记UBC2830扩增片段对油酸含量表型贡献率为43%，对亚麻酸含量表型变异的贡献率为13%，它在被变换成SCAR标记后可用于高油酸和低亚麻酸育种的标记辅助选择。张洁夫等[14]利用含油量较低的低芥酸甘蓝型油菜品系APL01(含油量37.03%，芥酸含量0.33%)和含油量较高的高芥酸抗菌核病品种‘M083’(含油量43.28%，芥酸含量42.65%)的回交群体，获得了两个与油酸含量相关的主效QTLs，它们分别位于N8连锁群的m11e37b—A0226Ba267和N13连锁群的m18e46—m20e25a，解释11.73%和27.14%的表型变异。钦洁[15]利用低芥酸低硫苷冬性品种‘甲A177’与高油酸低亚麻酸的欧洲春油菜‘甲A254’杂交获得F1代，并进一步获得DH系，在DH群体中检测到位于N5连锁群上的1个油酸主效QTL，它解释了84.6%的遗传变异，另外还检测到2个定位在N4和N14连锁群上的亚麻酸主效QTL，分别解释了59.0%和23.5%的遗传变异。陈伟[16]在低芥酸低硫苷冬性品种‘甲A177’与高油酸低亚麻酸的欧洲春油菜‘甲A254’的杂交组合中，利用BSA法筛选得到一个控制油酸含量的主效QTL，位于SSR标记SSR373和BRGMS630之间，它对油酸含量的贡献率为85.61%，利用两个标记一起进行油酸含量性状的前景选择，获得高油酸含量单株的正确率为94.12%；筛选得到两个控制亚麻酸含量的QTLs，分别解释了26.37%和25.18%的表型变异，由此推测亚麻酸含量性状可能受多个基因共同控制，筛选获得相关的分子标记有BM135、SSR698、BM44-2和SSR128-3。杨燕宇[17]利用无芥酸高油酸亲本‘HOP’和无芥酸低油酸亲本‘湘油15’杂交获得的F2代分离群体，用SSR标记构建遗传图谱，发现了2个油酸含量相关的QTLs，分别位于A5和C5连锁群上，它们分别解释59%和16%的表型变异，其中位于A5连锁群的QTL与FAD2基因有关。位于两个QTL峰值上的标记为BrG23Y12和BrP06Y06，它们分别对应白菜A5染色体上的KBrB063G23和KBrB087P06这2个BACs。杨庆勇[18]在鉴定出甘蓝型油菜中所有FAD2和FAD3基因的基础上，试图找到欧洲春油菜品系SW Hickory(油酸含量约为78%，亚麻酸含量小于3%)与普通双低冬油菜品系 JA177(油酸含量为64%，亚麻酸含量为8%)材料之间的FAD2基因差异，结果表明高油酸亲本SW Hickory中FAD2.a基因在第567和第568碱基对之间有一个4 bp的插入，该插入导致移码突变，终止密码子提前出现，据此开发了一个SCAR标记，可对油酸含量进行前景选择，同时，根据FAD3基因在亲本SW Hickory和JA177之间的单核苷酸差异，设计SNP标记用于低亚麻酸的分子标记辅助选择。

3 甘蓝型油菜芥酸含量的遗传与QTL定位

芥酸是十字花科植物种子油脂中含量较高的脂肪酸之一，具有较长的碳链，在人体内不容易消化吸收，对于食用菜籽油而言，无芥酸或低芥酸含量(小于3%)是判断菜籽油是否健康的一个重要指标，对于工业用菜籽油而言，高芥酸含量的菜籽油具有重要的经济价值。大量研究结果表明芥酸含量由A8和C3染色体上的2个主要的QTLs调控，另外，也受一些微效QTL的影响[19-22，23]。甘蓝型油菜中的BnaA08g11130D和BnaC03g65980D基因被证实是控制芥酸含量的2个主要基因，它们是拟南芥中控制芥酸含量基因FAE1的同源基因[24-29]。张洁夫等[30]用低含油量低芥酸的甘蓝型油菜‘APL01’与高含油量高芥酸品种‘M083’杂交获得F1，将F1与亲本‘APL01’回交得到的BC1F1为作图群体绘制遗传图谱，通过QTL扫描获得2个芥酸含量相关的QTL，分别为qER8和qER13，其中qER8位于N8连锁群的m11e37b和A0226Ba267标记之间，对芥酸含量的贡献率为16.74%；qER13位于N13连锁群的A0301Bb398和m18e46标记间，对芥酸含量的贡献率为31.32%。qER8和qER13两侧的4个标记m11e37b、A0226Ba267、A0301Bb398和m18e46可用于油菜低芥酸育种过程中。林兵等[31]在甘蓝型油菜A8连锁群上共检测到了14个芥酸含量相关QTLs，它们被整合成2个同义QTL，即qEA.A8.1和qEA.A8.2，其中qEA.A8.1是新发现的对种子芥酸含量具有显著性作用的位点，而qEA.A8.2对应的候选基因是FAE-1。汤天泽[32]认为特高芥酸性状主要受2对具有加性-显性-上位性效应的主基因控制，同时受到多基因控制，以主基因效应为主，并获得CB10364和BRMS-017这2个SSR标记，它们与芥酸含量紧密连锁，在单株中同时出现时菜籽油中芥酸含量>57%，能较好地检测出特高芥酸单株。

4 甘蓝型油菜中硫代葡萄糖苷含量的分子标记和QTL定位

4.1 硫苷的化学性质及生物活性

硫代葡萄糖苷(简称硫苷)是植物体内合成的一种含氮次级代谢产物，根据侧链基团的不同，硫苷可分为脂肪族、芳香族和吲哚族三大类，至今已分离得到120多种硫苷[33]。以十字花科植物如拟南芥、花椰菜和青花菜中硫苷含量最高[34]，且种子中的含量最为丰富。硫苷经由芥子酶水解后产生异硫氰酸酯、硫氰酸酯和腈等有生物活性的水解产物。早些年来，大田种植的油菜品种产生的菜籽油和菜籽饼中含有比较高浓度的硫苷，会对人体健康造成不利影响，畜禽等食用菜籽饼饲料后可能会引起脏器功能异常或出现中毒等症状，限制了菜籽饼作为蛋白饲料的应用方式[35]。但是，近些年来，育种学家和科学家为了降低菜籽油中硫苷和芥酸含量做了大量研究和努力，育成了大批具有优良农艺性状的双低油菜品种。

4.2 硫苷的遗传

油菜基因组中存在3个控制硫苷含量的主效QTLs，分别位于染色体A9、C2和C9上[20,22，36-37]，与拟南芥MYB28基因同源的序列有3个，这3个同源序列分别位于控制硫苷含量的3个主效QTLs区间内，它们被认为是控制硫苷含量变异的候选基因[20,29，37]。MYB28是控制脂肪族硫苷合成的一个转录因子[38]。Wang等[39]利用GWAS结合高通量基因组重测序以及表型分析方法检测甘蓝型油菜种子含油量、芥酸和硫苷含量的多态性位点，发现染色体A9、C2和C9上，调控硫苷含量的3个主效QTLs位点都存在MYB28基因，这进一步证实了MYB28基因可调控油菜籽中硫苷含量。Qu等[22]利用60K油菜SNP芯片对油菜籽中硫苷含量进行关联作图，发现11个与硫苷含量相关的SNP峰值，它们分别位于基因组A8、A9、C3和C9上，其中BnGRT2和BnMYB28基因被证实与硫苷含量相关。Marschalek等[40]发现控制甘蓝型油菜中硫苷含量的6个QTLs中，有3个QTLs起主效作用，分别位于连锁群9、16和18上，有3个QTLs的作用较小，分别位于连锁群2、3和6上。Lionneton等[41]发现4个控制丙烯基硫苷的QTLs和2个控制3-丁烯基硫苷合成的QTLs，并且有2个控制丙烯基硫苷合成的QTLs与控制3-丁烯基硫苷合成的2个QTLs相互连锁。Ripley等[42]发现，控制3-丁烯基硫苷合成的基因位于连锁群2和11上，而控制丙烯基硫苷合成的基因位于连锁群2和8上。

5 问题与展望

通过对油菜含油量及品质性状相关分子标记和QTL定位的研究进展进行综述，将前人的研究结果进行比较，归纳得到以下几点结果：(1)控制种子含油量的QTL位点非常多，目前被报道的含油量性状相关QTLs多达24个，已鉴定含油量相关的候选基因包括LPAAT(Bra037553)[6]、BnG27、BnG28、BnG30、BnG32、BnG36、BnG40、BnG44[7]、KASI、KASII、LPAAT、GPAT[8]等；(2)控制油酸含量的主效基因有N5连锁群上的fad2基因，对应于白菜A5染色体上的KBrB063G23这个BAC，另外，N8、N13和N15等连锁群上可能存在相关主效QTLs[12，15,17-18]；(3)可能存在2个控制亚麻酸含量的主效QTLs，分别为定位在N4连锁群上的fad3a和N14连锁群上的fad3c[12，15，18]；(4)甘蓝型油菜中与拟南芥FAE1同源的两个基因BnaA08g11130D和BnaC03g65980D被证实是控制芥酸含量的主效基因，另外，N6和N12、N7和N15、N8和N13等连锁群上可能也存在控制芥酸含量相关QTLs，其中位于N8连锁群的m11e37b和A0226Ba267标记间的qER8 对芥酸含量贡献率为16.74%，位于N13连锁群的A0301Bb398和m18e46标记间的qER13对芥酸含量的贡献率为31.32%。qER8和qER13两侧的4个标记可应用于油菜低芥酸育种过程中，另外，N8连锁群上的CB10364和BRMS-017这2个SSR分子标记与芥酸含量紧密连锁，在单株中同时出现时，芥酸含量>57%，能很好地应用于特高芥酸单株的检测中[24-26]；(5)油菜基因组中存在3个控制硫苷含量的主效QTLs，它们分别位于染色体A9、C2和C9上，这3个主效QTLs上的候选基因可能是拟南芥MYB28基因在油菜中对应的3个同源基因，另外，BnGRT2基因也被证实参与硫苷含量的调控，这些研究结果被高通量测序和SNP芯片结果证实[40-42]。目前，通过SSR和AFLP等分子标记方法对甘蓝型油菜中的性状相关基因进行QTL定位和进一步的候选基因筛选仍存在一些困难：首先，控制油菜含油量以及品质性状的微效基因非常多，这些基因通过显性效应、加性效应、上位性效应以及基因与环境的互作效应形成一个非常复杂的调控网络，只有将多个QTL位点或基因进行有效聚合才能较大程度提高种子含油量和改良菜籽油品质；第二，由于甘蓝型油菜是异源四倍体，基因组较大且重复序列多，而控制性状的基因多数都是数量性状基因，因而对这些基因进行QTL定位时常会得到多个QTL位点，主效基因或微效基因分布在多个连锁群中，筛选候选基因的范围扩大，需要开发大量的新的分子标记才能获得高密度遗传图谱进而进行QTL定位或候选基因筛选，工作量很大。

分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)是直接依据个体基因型进行选择，克服了传统育种中通过表现型间接对基因型进行选择造成的周期长、效率低、准确率低的缺点，可节约育种时间，提高育种效率。虽然近几年来大量QTLs和分子标记被发现和开发，但是应用到育种和生产实际中的分子标记相对较少。陈伟等[16]利用筛选的油酸主效QTLs两侧的SSR标记(BRMS007和BRGMS630)，以及与亚麻酸含量相关的4个SSR标记(sN2025、BoGMS798、Nal2-D09和0110-D03)进行甘蓝型油菜高油酸和低亚麻酸植株的选育，最终在BC2F2和BC3F2代获得高油酸和低亚麻酸单株；刘梓谕等[43]筛选得到一个EST标记OC2-1，与含油量性状关联达极显著水平，可在MAS中直接使用；Javidfar等[13]一共获得了8个RAPD标记，它们与油酸和亚麻酸含量相关联，其中标记UBC2830扩增片段对油酸和亚麻酸含量贡献率分别为43%和13%，它在被变换成SCAR标记后可用于高油酸和低亚麻酸育种的标记辅助选择；汤天泽[32]围绕油菜籽的特高芥酸含量性状展开了一系列遗传研究，获得CB10364和BRMS-017这2个SSR标记，它们与芥酸含量紧密连锁，能较好检测特高芥酸单株，可用于分子标记辅助选择。近几年来，随着白菜、甘蓝和甘蓝型油菜基因组测序完成并且序列注释的逐渐完善，寻找和开发分子标记的工作变得更加便利，开发更多的SSR、AFLP等分子标记将有利于更高密度的遗传图谱的绘制、QTL的精细定位及候选基因的筛选。分子标记辅助育种作为油菜育种的重要途径，可进一步进行高效育种，获得更多更好的高产、优质、高抗油菜品种。