超高效液相色谱-串联质谱法在农药残留检测中的应用

蒋 剑，靳艳玲，马 丽

（1广电计量检测（成都）有限公司，成都610045；2中国科学院成都生物研究所，成都610041；3四川出入境检验检疫局，成都610041）

0 引言

2004年，Waters公司推出了全球第一台超高效液相色谱仪(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)。近年来，由于仪器仪表、检测器设计、数据处理和小颗粒填料领域的重大进步和创新，UPLC法得到了快速发展[1]。UPLC采用低扩散、低交叉污染的进样器，将样品注入不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相中，再由具有精确梯度的超高压色谱泵泵入装有小粒径固定相的色谱柱内，在柱内由于被测不同物质与固定相的相互作用不同，顺序离开色谱柱，而使各成分被分离，根据待测物质的特征采用相应的高采样速度的灵敏检测器进行检测，从而实现对试样的分析[2]。进样器、色谱泵、色谱柱、检测器的升级使UPLC的分析速度较HPLC提高了9倍，分辨率提高了2倍，灵敏度提高了3倍[3]，且因分析速度的提升缩短了分析时间，还同时通过减少溶剂用量降低了分析成本。

串联质谱(tandem mass spectrometry，MS/MS)由2个质谱串联而成，第一级质谱(MS 1)使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经过氮气、氩气等碰撞气碰撞活化，再经过第二级质谱(MS 2)进行质量分析[4]，分析这些离子可获得化合物的分子量、化学结构、裂解规律和由单分子分解形成的某些离子间存在的某种相互关系等信息。

超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)则结合了超高效液相色谱仪有效分离热不稳定性及高沸点化合物的分离能力与质谱仪的组分鉴定能力，能确保对超痕量物质的低检测限，具有高性能和可靠性标准，是一种分离分析复杂有机混合物的有效手段，已成为很多领域高性能定量和鉴别检测的“金标准”[5-8]。

根据Web of Science的检索，自2004年第一台UPLC问世起至2018年这15年间，以UPLC-MS/MS检测农药残留为主题的文献共209篇，并有逐年增加的趋势，仅近5年的文献数量就占了一半以上，表明UPLC-MS/MS在农药残留检测方面的科研和应用正逐渐成为该领域的研究热点。农药残留的检测样本多为生物样品，成分复杂，内源性物质的绝对量常高于待测物质数倍，不同类型基质样品的检测方法有其各自的特点。因此，笔者对近年来国内外UPLC-MS/MS在不同基质中农药残留检测的有关研究做综述，以期为食品安全和环境分析中农药残留的检测实践及科学研究提供参考。

1 蔬菜、水果

蔬菜和水果是人们日常最可能接触的农药残留的来源，因此，国内外很多学者都建立了相应的UPLCMS/MS检测方法。在建立UPLC-MS/MS检测农药的方法时，除要选择合适的超高效液相色谱柱、确定离子源电离模式、优化色谱分离条件和质谱分析条件外，最重要的环节在于样品的前处理[9]，通过前处理工艺提高目标农药的提取、净化程度[10]。蔬菜和水果为含水量大、含脂肪少的固体样品，在农药残留分析中，其前处理过程比一般液体样品复杂，也要消耗更多时间[11]。Chen等[12]建立了检测蔬菜（黄瓜、番茄和胡椒）和水果（葡萄、苹果）中氟唑菌酰胺及3种具有毒理学意义的代谢物3-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸，3-(二氟甲基)-N-三氟联苯-1H-吡唑-4-羧胺和3-(二氟甲基)-1-β-D-吡喃葡萄糖基-N-三氟联苯-1H-吡唑-4-羧胺的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法，样品用甲酸-乙腈提取后，用十八烷基硅烷吸附剂净化，经1.8 μm的T3色谱柱分离，离子源采用电喷雾负离子模式(ESI-)，检测限0.14 μg/kg，定量限0.47 μg/kg。

为简化吸附、净化工艺，有一些成套的前处理流程被公开并应用于UPLC-MS/MS检测，如欧盟农药残留参考实验室Anastassiades等[13]开发的QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)法。由于QuEChERS方法简便、快捷、经济、高效、安全等特点，自发布以来，获得了美国分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)、欧盟等多个国际机构认可，广泛应用于食品中农药残留分析[14]。鲁红等[15]利用QuEChERS前处理技术结合超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱，同时检测了蔬菜中敌敌畏、毒死蜱、乐果、氧乐果4种有机磷农药残留，检测限为0.25～0.40 μg/kg，定量限为0.73～1.00 μg/kg，加标回收率为80%～98%。郭虹等[16]建立了蔬菜中噻苯隆、2，4-二氯苯氧乙酸、赤霉素、4-氯苯氧乙酸、氯吡脲、多效唑和烯效唑等7种植物生长调节剂的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱检测方法，样品用ProElut QuEChERS萃取盐包盐析分层后过C18净化柱，为提高检测的灵敏度和准确度，同时采用正、负双离子扫描MRM监控模式，检出限为0.17～0.53 μg/kg，定量限为0.55～1.9 μg/kg，回收率为80.1%～118.3%。另外，欧盟农药残留参考实验室在2011年制订了极性农药的快速分析方法QuPPe(Quick Polar Pesticides)，并分别针对植物源[17]和动物源农药[18]检测公布了操作流程。吴延灿等[19]应用QuPPe前处理技术结合超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱建立了检测黄瓜、番茄、甘蓝、马铃薯中呋虫胺及其代谢物的方法，前处理后的样品，经1.7 μm的C18色谱柱进行分离，采用电喷雾正离子(ESI+)模式，多反应监测模式(MRM)检测，检出限为0.04～0.66 μg/L，定量限为 0.13～2.20 μg/L，回收率为72.0%～109.1%。

为提高目标农药的萃取工作效率，一些与UPLCMS/MS配套使用的前处理仪器得以开发上市。纪律等[20]建立了竹笋中百草枯残留的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱检测方法。为了提高百草枯的萃取工作效率，结合了快速溶剂萃取和固相萃取技术，以甲醇-盐酸作为萃取溶剂，利用快速溶剂萃取仪提取竹笋中的百草枯，再经Oasis WCX固相萃取柱萃取。质谱电离方式为ESI+，检出限为2 μg/kg，定量限为5 μg/kg，回收率为80.9%～95.6%。

当检测物质不容易被检测时，如无紫外吸收等，为增强检测器对目的物的响应，需要进行衍生化处理[21]，这点与气相色谱(GC)和液相色谱(LC)的前处理方法是一致的。针对仲丁胺分子量小、结构上没有生色基团用于最终检测、常用的柱前衍生剂2，4-二硝基氟苯的毒性较大这些问题，王永莲等[22]建立了葡萄、白菜和青椒中仲丁胺的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱检测方法，采用丹磺酰氯在pH 9.0的碳酸盐体系下进行衍生反应，经1.8 μm的C18色谱柱分离，ESI+模式，检出限为 2.0 μg/kg，定量限为 5.0 μg/kg，加标回收率为81.0%～97.3%。

2 粮油作物

粮油作物具有低含水量、高淀粉、高蛋白、高脂肪等特点。针对这些特点，陈晓英等[23]建立了粮谷中噻虫胺、乙氧氟草醚、杀虫脒、异丙隆、异稻瘟净、抑霉唑、三唑磷、氧乐果等18种农药的超高效液相色谱-串联四极杆质谱检测方法，样品经乙腈提取后中性氧化铝柱净化，用1.7 μm的C18色谱柱分离，ESI+模式，检测限0.001～0.477 μg/kg，定量限0.01～1.59 μg/kg，其中有13种农药加标回收率为80%～104%，另5种回收率为62%～84%。户江涛等[24]采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质法，建立了快速检测大豆中草甘膦(PMG)及其在植物中的主要代谢物氨甲基膦酸(APMA)残留量的分析方法。针对大豆为高蛋白、高脂肪含量的特殊基质这一特性，采用二氯甲烷前处理去除脂肪；针对PMG和APMA极性均较强、不易挥发、无紫外吸收、常规方法分析检测较困难的问题，采用9-芴甲氧羰酰氯进行柱前衍生，定量限为0.01 mg/kg，回收率为77.7%～91.5%。针对向日葵种子这类高脂肪、高蛋白类基质，Shi等[25]合成了甲胺改性石墨烯，并将其作为固相萃取剂用于噻虫嗪、吡虫啉、啶虫脒等新烟碱类杀虫剂的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法测定，检出限0.05～5.7 ng/kg，定量限 0.2～19.1 ng/kg，加标回收率74.3%～119.1%。

3 其他固体基质

Lehmann等建立了头发中乙草胺、溴氰菊酯、甲氧滴滴涕等28种农药的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱检测法，采用Z-SEP分散固相吸附剂前处理样品，经1.8 μm的T3色谱柱分离，检测限0.5～6.3 μg/kg，其中拟除虫菊酯类农药受基质效应的影响最大，所以定量限值较高，而莠去津、阿特拉津、吡虫啉检出限低于1 μg/kg，达到了较高的灵敏度[26]。

水产品相比于植物、水及土壤具有高脂肪、高蛋白、基质复杂的特点，为此，刘慧慧等[27]建立了鲤鱼、南美白对虾、中华绒鳌蟹、文蛤和海参等水产品中氟胺磺隆、甲磺隆、苯磺隆、烟嘧磺隆等13种磺酰脲类除草剂的固相萃取-超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱检测分析方法。样品经乙酸乙酯提取，考察对比了MAX固相萃取柱、C18固相萃取柱、HLB固相萃取柱和GPC凝胶色谱对提取液的净化效果，确定样品采用MAX固相萃取柱净化，ESI+模式电离，检出限为1.0 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg，加标回收率75.4%～118.3%。张乐等[28]建立了水产品中磺胺吡啶、磺胺嘧啶等62种药物残留的超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱方法。采用正离子扫描，质谱Fullms-dd（一级全扫描+自动触发二级质谱扫描）模式进行采集分析，检出限为10 μg/kg，加标回收率48.3%～105.8%。

茶叶基质含有多种复杂成分，包括多酚、生物碱、色素和酚酸，为降低基质效应，Hou等[29]用聚乙烯醇聚吡咯烷酮(PVPP)从茶基质中去除多酚，PSA和GCB固相萃取，建立二硝基呋喃类、尼群吡仑、氯噻嘧啶等8种新烟碱类杀虫剂的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱检测法，经1.8 μm的C18色谱柱分离，ESI+模式，方法定量限0.01 mg/kg。Zhao等[30]用Cleanert TPT茶叶专用固相萃取小柱净化样品，建立了同时检测茚虫威、醚菌酯、啶氧菌酯等18种农药残留的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱检测法，经1.8 μm的C18色谱柱分离，ESI+模式，检测限0.03～1.5 μg/kg，加标回收率70%～110%。

对于淀粉来说，虽然本身杂质很少，但是前处理过程也不能直接参考其他基质的样品，因为淀粉在乙腈等有机溶液中会产生溶胀现象，导致提取液无法完全回收，从而影响方法的定量。为准确测定淀粉中的多农药残留，余巍等[31]将液液萃取前处理方法与超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(Q Excative)结合，采取在淀粉中加水后用乙腈溶液提取的方法，经1.9 μm的Hypersil Gold aQ色谱柱分离，一级质谱ESI+模式全扫描配合数据依赖二级子离子全扫描模式，在14 min内快速筛查淀粉类产品中的224种农药残留，有208种农药的检出限达到1 μg/kg，224种农药的定量限均小于或等于10 μg/kg。

针对中草药复杂成分带来的基质效应，Mao等[32]采用改进的QuECHESS程序提取农药，用凝胶渗透色谱(GPC)和分子印迹固相萃取(MISPE)净化样品，建立了草净津、敌草净等三嗪类化合物的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法，检测限低于3 μg/kg，回收率60%～100%。Chen等[33]建立了贝母、板蓝根、板蓝根、桃仁、金银花等中草药中灭克磷、仲丁威、马拉氧磷等53种农药的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法，净化过程采用了伯仲胺、石墨化炭黑和十八烷基硅烷的分散固相萃取，比较了电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)模式的灵敏度及准确性，结果表明，虽然APCI受样品基质组分产生的电离抑制影响较小，但是对于大多数农药来说，ESI的检测限比APCI低。这一结果也是绝大多数UPLC-MS/MS检测农药时采用ESI电离模式的原因。

4 液体基质

饮用水具有基质比较干净的特点，陈永艳[34]、庄乾坤[35]等分别建立了直接进样-超高效液相色谱串联质谱法，样品经0.22 μm滤膜过滤后直接进样检测莠去津及其代谢产物、三唑类杀菌剂。陈永艳等比较了50 mm 和 100 mm 的 1.7 μm UPLC BEH C18柱以 及1.8 μm UPLC HSS T3色谱柱分别以乙腈-纯水、甲醇-纯水、乙腈-0.1%甲酸水为流动相进行洗脱的效果，结果莠去津及其代谢产物在BEH C18色谱柱上以乙腈-水为流动相，在4 min内完全分离，检出限为0.0005～0.04 μg/L，回收率74.7%～104.3%。庄乾坤等考察了甲醇-0.15%甲酸溶液、甲醇-10 mmol/L乙酸铵溶液、乙腈-0.15%甲酸溶液和乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液对三唑类杀菌剂分子的离子化效率，最终选择乙腈-0.15%甲酸溶液作为流动相，三唑醇、亚胺唑、腈菌唑、戊菌唑、氟硅唑和丙环唑等6种三唑类杀菌剂的检出限为0.017～0.035 μg/L，定量限为0.058～0.115 μg/L，回收率为89.5%～104.5%。

针对农药在一般水环境中痕量的特点，Lu等[36]建立了金属有机框架(MOF)材料作为吸附剂用于辅助微量固相萃取的前处理方法，用于甲硝唑、二甲硝咪唑、替硝唑等5-硝基咪唑类的超高效液相色谱-串联质谱法检测检测限0.03～0.06 μg/L，定量限0.09～0.20 μg/L，回收率75.2%～98.8%。金晶等[37]建立磁性固相萃取-超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法，测定水样中灭草隆、异丙隆、绿麦隆、敌草隆等4种苯脲类除草剂含量的方法。前处理采用二乙烯基苯（疏水基）和吡咯烷酮（亲水基）修饰的磁性纳米材料，利用疏水基团阻止磁性材料进一步溶解在水中，利用亲水基团吸附水溶性较好的苯脲类除草剂，且将水样调节pH 3.0时目标物的回收率最高，经1.8 μm的反向C18色谱柱分离，检出限12.5～16.4 ng/L，回收率为83.7%～107%。Quinete等[38]利用自动固相萃取仪对水样中的硫丹进行提取，利用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱检测硫丹异构体和硫丹盐，离子源为大气压化学电离负离子模式(APCI-)，硫丹硫酸盐、α-硫丹和β-硫丹的检出限分别低至3、10、7 ng/L。

血液中干扰测定的主要是蛋白，因此Singh等[39]建立了大鼠血浆中氰戊菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯、氟氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等7种拟除虫菊酯类农药的蛋白质沉淀-超高效液相色谱-串联质谱检测法。该方法的特点在于样本体积小，仅100 μL，而且总色谱运行时间仅5 min。而腐败血液中成分更为复杂，可能含有大分子蛋白质、脂肪、多糖的降解产物、活体微生物，小分子胺类、醛酸等，因此，郭震等[40]按照QuEChERS方法使用水-乙腈(1:4)作为提取溶剂配合超声作为辅助手段，避免了有机溶剂使腐败血液转为粘稠血块而导致回收率偏低的情况，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱检测24种常见投毒农药，考察了5种色谱柱对目标物的色谱分离效果，最终选择母离子提取色谱图峰形好、无拖尾的UPLC HSS C18色谱柱，质谱为ESI+模式，采用全信息串联质谱扫描(MSE)，检出限0.43～10.0 μg/L。

5 展望

超高效液相色谱-串联质谱的应用范围非常广泛，尤其在复杂基质中混合目标物的检测方面有很好的应用前景。为了使如此贵重的设备更好地服务于检测实践，笔者系统梳理了近年来UPLC-MS/MS在农药残留检测方面的国内外文献，总结了建立UPLC-MS/MS方法时需要考虑的主要因素。相信随着仪器的不断升级和检测方法的不断改进，超高效液相色谱-串联质谱将在农药残留检测，尤其是痕量多农药残留检测方面发挥越来越重要的作用。

5.1 串联质谱类型

目前，很多检测实验室都已配备或计划购置UPLC-MS/MS。根据质量分析器不同，一般采用的为串联三重四极杆质谱(Quadrupole Quadrapde Quadrupole Mass Spectrometry，QqQ MS)，QqQ因为具有毋庸置疑的定量能力，加上相对较低的价格得以广泛应用于科研、质检和商检机构，但是其分辨力和扫描速度一般都低于飞行时间质谱(Time of Flight Mass Spectrometry，ToF-MS)、轨道离子阱质谱(Orbitrap MS)和线性离子阱(Linear Ion Trap)等使用脉冲采样方式的质谱仪，而ToF和离子阱质谱相对较高的价格又在一定程度上限制了其应用。因此，有些国外的实验室采用装备数台QqQ并配备一台离子阱或者ToF的方式来弥补定性方面的不足。

根据离子源不同，与UPLC串联的质谱可用电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、大气压光电离(APPI)以及基质辅助光解吸离子化(MALDI)。ESI适合极性比较大的化合物和大分子化合物，且适于热不稳定化合物，这也是其在农药检测方面应用最为广泛的主要原因；APCI适用于中等极性或弱极性化合物的检测，不适用于热不稳定化合物；APPI使用得比较少，适于非极性和弱极性化合物的分析；MALDI常用于ToF质谱检测。

5.2 前处理条件

欧盟农药残留参考实验室制定QuEChERS和QuPPe对于不同类型的样品提出了成套的前处理流程，具有简便、快速、高效的特点，在国内已获得一定的认可。但在具体应用时，还应根据实际检测效果进行适当调整，如超声辅助提高回收率、调节pH值提高回收率、更换盐的种类以避免板结等。一般来说，增加前处理步骤可以减少基质效应的干扰，但也会造成回收率降低；而减少前处理步骤可以避免回收率的损失和引入其他影响分析的因素，但基质效率的去除效果往往较差。在建立方法时，应首先考虑如何降低回收率的损失，如果在此条件下无法兼顾基质效率的消除，则可采用相应空白基质溶液配制标准溶液绘制校正曲线以获得更准确的结果，有条件的实验室也可尝试加入同位素内标。

5.3 超高效液相色谱条件

对于极性不同的混合目标检测物来说，色谱柱对各待测物的响应值至关重要。一般来说C18柱对中弱极性农药均有良好的分离和保留作用，而有些色谱柱如Hypersil Gold aQ柱同时还对极性物质具有较好的分离和保留作用，可以根据待测物的特点在比较检测效果的基础上做出选择。当样品溶液与初始流动相差别较大时，出峰时间较早的化合物的色谱峰会出现分叉或变宽的现象，为避免这种溶剂效应，对于梯度洗脱，采用初始的流动相比例；对于在流动相中溶解度小，必须用强溶剂的时候，减少进样体积以消除溶剂效应的影响。

5.4 质谱条件

对于质谱检测来说，待测物只有被离子化后才能被检测到，需要根据待测化合物的性质选择正负离子模式，化合物结构不同，生成的离子带的电荷就不一样。碱性化合物易带正电荷，加和质子或其他正电荷离子；酸性化合物易带负电荷，失去质子或加和其他负电荷离子。因此，需要在充分掌握待测化合物性质的基础上加以选择。