NPTX2基因DNA甲基化与胰腺癌的研究进展

章俊亚, 陈吉祥

胰腺癌是全球癌症相关死亡的第5大病因,其5年生存率仅为7%[1-2]。胰腺癌患者早期缺乏特异性症状且进展迅速,确诊时往往已发生局部浸润和远处转移,失去手术切除机会[3-6]。据统计,仅10%～20%的胰腺癌患者可接受手术治疗,不接受手术治疗的患者,平均生存时间为确诊后3～6 个月[7]。此外,胰腺癌对化疗药物具有高度的抗性,化疗效果不佳[8]。一些有创、侵入性的临床辅助检查,如内镜下逆行胆胰管造影(ERCP)、腹腔镜超声内镜等,有出现胰腺炎并发症的可能[9]。因此,探索胰腺癌早期诊断的潜在标志物以及治疗靶点,已成为胰腺癌研究领域的热点。糖基抗原CA 19-9是迄今报道的胰腺癌敏感性最高的标志物,但通常在胰腺癌的晚期出现异常升高,在肝癌、胆囊癌等其他肿瘤,风湿性关节炎,急慢性胰腺炎等也可出现升高趋势[10]。

肿瘤的发生是由传统基因遗传学和表观遗传学调控共同作用的结果。表观遗传学调控是在不发生原始DNA序列变化的前提下,在细胞分裂过程中对调控基因进行修饰,使遗传物质改变并随着细胞的增殖向下遗传,进而参与肿瘤的发生、发展。表观遗传学调控机制主要包括DNA甲基化、染色质的组蛋白修饰(包括甲基化、乙酰化等)、基因印迹以及RNA干扰等。DNA 甲基化在胰腺癌的发生、发展中起着关键性的作用,能够使某些抑癌基因失活,从而促进致癌的过程。先前研究证实在胰腺癌中,神经元正五聚体蛋白Ⅱ(neuronal pentraxin Ⅱ,NPTX2)NPTX2基因的启动子区域CpG岛发生异常高甲基化[11]。DNA甲基化可能是导致胰腺癌中NPTX2蛋白功能失活、表达沉默的机制之一。就此,本文对NPTX2 的 DNA 甲基化在胰腺癌中的最新研究进展做一综述。

1 NPTX2基因

NPTX2基因位于人类七号染色体(7q21.3-q22.1)，长度为11 kb，其编码的神经元正五聚体蛋白Ⅱ是一种神经突触蛋白，能够参与兴奋性突触的形成，最初在帕金森病中被发现，广泛存在于胰腺、肝脏、大脑、骨骼肌等组织[12-13]。NPTX2是神经元正五聚蛋白家族(neuronal pentraxin，NPs)中的成员之一，该家族其他成员有神经元正五聚体蛋白Ⅰ(neuronal pentraxin Ⅰ，NPTX1)、神经元五聚蛋白受体(neuronal pentraxin receptor，NPTR)，NPTX2蛋白能够和NPTX1、NPTXR结合形成异聚体[14]。NPTX2具备五聚体家族蛋白的特点：①由5个一致的非共价结合的亚基呈放射状排布所形成的五聚体，其形成的过程不依赖Ca2+；②标志性序列形式为H-X-C-X-S/T-W-X-S/T(X可代表各种氨基酸)；③依赖Ca2+和各种配体结合，在Ca2+存在环境下，可与太攀蛇毒素(一种高效的异木防己碱毒素，能够阻断突触前的神经-肌肉传导)和腔内钙结合蛋白TCBP49结合[15]。根据NPTX2这一生化特性，常将其作为该蛋白分离纯化的一种有效方法。

NPTX2与人体多种疾病相关。例如,NPTX2蛋白在患有阿尔兹海默病的患者脑脊液中减少,且与患者认知表现和海马体积具有显著相关性[16];NPTX2过度表达能够减轻应激诱导的焦虑行为,在焦虑症治疗中起着潜在的重要作用[17];NPTX2的表达下降可能参与了发作性睡病的发病机理[18];NPTX2还被发现参与了人类神经母细胞瘤的发生发展[19]。近年来,诸多研究对NPTX2在胰腺癌方面的研究越来越多,为胰腺癌发病机制的探索提供了新的理论指导和方向。

2 DNA甲基化

DNA甲基化是最重要的表观遗传改变之一,在肿瘤的发展中起着关键的调控作用,异常的DNA甲基化涉及启动子CpG岛的CpG高甲基化状态,最终导致肿瘤抑制基因沉默或通过促进基因组的不稳定从而导致染色体的缺失[20]。DNA甲基化则是在 DNA甲基化转移酶的催化下,胞嘧啶的第5位碳原子与S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基结合生成5′-甲基胞嘧啶的过程。在真核细胞中,DNA 甲基化大部分出现在 5′-GC-3′ 核苷酸即CpG上[21]。富含CpG 的DNA区域被称为CpG岛,CpG 一般位于基因的启动子区附近,长度为300～3 000 bp。在正常情况下,CpG 岛以非甲基化形式存在,当CpG 岛发生异常甲基化(以过甲基化为主)时,甲基化结合蛋白以及转录抑制物组蛋白乙酰化酶等结合到CpG岛,使转录因子结合启动子的过程受阻,从而导致启动子区域下游基因的失活[22]。

DNA异常甲基化广泛出现在各类肿瘤中,在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。Chou等[23]发现抑癌基因ABCA1在卵巢癌细胞系中出现高甲基化,且与卵巢癌患者的不良预后密切相关。另有研究发现,在肺癌组织中检测到DBCCR1基因CpG岛的高甲基化水平,致该基因的表达沉默,增强了癌细胞迁移、侵袭的能力,被认为是早期肺癌的诊断指标之一[24]。Chen等[25]研究表明,TMEFF2 基因启动子区异常甲基化与子宫内膜癌的早期发生相关。同样,许多与胰腺癌发病有关的基因也出现启动子区域的高甲基化修饰,例如参与DNA 转录调控的基因INSM2、调控细胞增殖的基因GAS6、与凋亡相关的基因IRF5等均发生了启动子区的异常甲基化,出现基因功能紊乱、表达抑制,进而导致肿瘤形成[26-28]。DNA甲基化改变通常发生于细胞癌变过程的早期阶段,因此它能够作为肿瘤发生的重要危险因素和早期诊断的分子标志物,将甲基化检测投入到高危人群的筛查,提高早期诊断的准确性。

3 NPTX2的DNA甲基化与胰腺癌

2003年,Sato等[11]通过高通量微阵列技术的研究,发现NPTX2基因在胰腺癌组织中表达下降,同时其启动子区CpG岛发生异常高甲基化,而正常胰腺组织细胞中很少出现甲基化,表明NPTX2基因的表达抑制可能参与了胰腺癌的发生发展过程,且该基因表达抑制可能与DNA高甲基化相关。随后,有关于胰腺癌中NPTX2的DNA异常甲基化的研究陆续地开展起来。2006年,Matsubayashi等[29]在胰腺癌的胰液中发现了一些高甲基化基因:NPTX2、Cyclin D2、FOXE1、p16、ppENK和TFPI2,其中NPTX2基因相比于其他基因检测的敏感性更高。2007年,Park等[30]运用超声内镜结合胰管刷检技术获取了33例胰腺癌患者及22例良性胰胆病患者的细胞样本,从中提取细胞基因组DNA,NPTX2基因的启动子区域 CpG岛高甲基化序列经过亚硫酸氢盐处理修饰后,设计相应引物与该序列互补配对,通过定量甲基化特异PCR法(quantitative methylation-specific PCR, QMSP)进行检测,结果发现胰腺癌细胞中NPTX2甲基化明显增高,认为NPTX2高甲基化的定量分析将有望成为一种胰腺癌分子诊断标志物。2012年,Park等[31]再次采集了169例患者的血液标本进行研究,其中包括104例胰腺癌患者,60例慢性胰腺炎患者,5例良性胆道结石病患者,并从每例患者的血浆中提取DNA,通过QMSP法检测NPTX2基因CpG岛高甲基情况。结果表明,相比于慢性胰腺炎组和良性胆道结石组,胰腺癌组NPTX2的高甲基化水平显著增高。同时,观察比较了NPTX2高甲基化在胰腺癌各阶段的表达倍数变化,发现随着美国癌症联合会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)TNM分期的进展,该基因甲基化的水平随之显著升高,在胰腺癌进展期尤为显著。紧接着,Zhang等[32-33]证实了NPTX2在胰腺癌中的低表达与其启动子区域的高甲基化联系紧密,并且指出NPTX2作为一种抑癌基因,能够使细胞G0/G1期阻滞,促进细胞凋亡,抑制细胞侵袭、转移。

筛选出一个有助于胰腺癌早期诊断的基因甲基化位点,须满足以下几项基本条件[34-35]:①在胰腺癌细胞中,候选基因同时发生异常甲基化和异常表达;②候选基因大部分在胰腺癌的早期发生异常甲基化;③在正常胰腺细胞中,候选基因能够正常表达,同时该基因启动子区处在低甲基化或者非甲基化的状态。与此同时,基因的异常甲基化易于在临床常规检查样本中(如血尿粪、细胞组织活检标本等)检测出来,这也是候选基因筛选的一项必要条件[36]。NPTX2的CpG区高甲基化有望成为早期胰腺癌初筛的分子标志物和治疗靶点。目前,甲基化检测实验得到了临床试验的评估,主要通过甲基化特异PCR法对有家族病史的胰腺癌患者的胰液进行检测,但该实验的敏感性和准确性未经证实。所以,对于NPTX2基因的甲基化检测的敏感性及特异性,有待技术的改进,做进一步的研究考证。

针对DNA甲基化是一种发生在肿瘤早期、多发及可逆的遗传表观学改变,先前Sato等[11]通过一种甲基化酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC),又名地西他滨,处理了3种胰腺癌细胞系(AsPC1、PanC1、MiaPaCa2),随后发现NPTX2基因的表达明显增高。可见,抑制甲基化的过程可在某种程度上恢复抑癌基因NPTX2的表达活性,这也为早期胰腺癌的分子靶向治疗提供了新的思路。

4 结论和展望

综上,NPTX2作为一种胰腺癌的抑癌基因,该基因的表达异常可能与异常DNA甲基化有关。广泛研究发现,DNA高甲基化抑制了NPTX2基因的表达,促进了胰腺癌的发生发展。同时,DNA异常甲基化被证实是一种可逆的表观遗传改变,能够通过抑制甲基化的过程来激活被沉默的抑癌基因。对于NPTX2基因DNA异常甲基化的研究,将会为胰腺癌的早期诊断、靶向治疗以及预防提供新的研究领域。目前,尽管证实了NPTX2基因异常甲基化参与胰腺癌发病进展,但是该基因在胰腺癌中所调控的通路仍不得而知,需要通过基础实验进一步阐明其在致癌过程中确切的分子机制。同时,其甲基化检测在临床中的应用还有待于进一步证实。因此,有必要对NPTX2基因的DNA异常甲基化在胰腺癌中的调控机制做更为深入的研究。