环状RNA在神经胶质瘤中的研究进展

戚前生， 赵红， 刘建雄

神经胶质瘤是1种起源于中枢神经细胞的肿瘤，占中枢神经系统肿瘤的27%，以发病率高、死亡率高、侵袭性强、预后差为主要特点[1]。近年来神经胶质瘤患病率逐年增加，尽管在诊断和治疗方面取得了明显进展，但患者的中位生存率依旧较低[2]。最近的研究发现，circRNA在神经胶质瘤的基因调节、发生发展、表达和迁移中都起着重要的调节作用，可作为神经胶质瘤靶向治疗的新方向及疾病诊断和预后的生物学标志物[3]。

1 概述

circRNA是1种特殊的内源性非编码RNA，由前体RNA的3′末端与5′末端首尾相连形成闭合环状结构[4]。20世纪70年代，circRNA在RNA病毒中首次发现，但未引起足够重视[5]。随着RNA测序技术和生物信息学的快速发展，Salzman等[6]证明circRNA在哺乳动物中广泛存在，并具有高度稳定性、保守性以及调控的复杂性，在疾病的发生、发展过程中扮演着重要角色[7]。

1.1 circRNA可作为 miRNA海绵因子 miRNA是一大类非编码小RNA，主要通过碱基互补配对直接绑定在信使RNA(mRNA)上，circRNA几乎参与了肿瘤相关的所有过程，包括增殖、分化、凋亡、转移及血管生成等。2013年，Hansen等[8]首次证明了circRNA以吸附miRNA的方式(即miRNA的海绵作用)来发挥作用，circRNA富含miRNA结合位点并在细胞中充当miRNA海绵，从靶基因位点上隔离miRNA进一步影响了mRAN的翻译[9]。同时circRNA还可因分子海绵的作用来保护3′非翻译区(3′-UTR)免受miRNA的攻击[10]。现多项研究已证实了circRNA在神经肿瘤组织、心血管系统疾病中发挥重要作用，并取得重大成果[11]。

1.2 circRNA是转录、剪切的调节器 circRNA通过与染色质或其亲本基因的启动子结合来激活转录的表达并调控亲本基因[7]。研究发现，外显子-内含子circRNAs中含有的环状PAIP2(circPAIP2)和环状EIF3J(circEIF3J)，能够与U1小核核糖核蛋白抗体(U1snRNP)结合形成复合物，并可与RNA 聚合酶 Ⅱ(polⅡ)相互作用进一步促进亲本基因的转录[9]。CircRNA剪接过程与mRNA不同，在前体RNA剪接过程中，反向剪接产生的 circRNA 能够竞争性调控可变剪接。剪接因子(MBL)与环状RNA剪切因子结合物(circMbI)紧密结合并相互影响各自的表达[12]。

1.3 CircRNA的编码蛋白功能 乙型肝炎病毒(HBV)的亚病毒——丁型肝炎病毒(HDV)是最早期在真核细胞中发现的能编码蛋白质的circRNA[13]。1995年Chen等[14]通过核糖体扫描模型技术进一步证实了circRNA在真核细胞中具有编码蛋白质的功能；并且发现circRNA可以直接与核糖体IRES元件(内部核糖体进入位点)结合或在mRNA的5′末端结合后转移到IRES上，从而进一步编码相应蛋白质。其中，Circ-ZNF609是1种可在真核细胞核糖体上转译的circRNA。其转译过程与线性转录类似，Circ-ZNF609基因包含了从起始密码子到终止密码子的开放阅读框(ORF)，以此来转录特定基因。但Circ-ZNF609的翻译形式与5′-3′翻译形式不同，其主要依赖于剪接的方式被翻译成蛋白质，这也在真核生物的蛋白质编码circRNA中提供了实例[15]。此外，Pamudurti等[16]应用核糖体印记技术在果蝇中找到了许多与翻译核糖体相关的circRNA，并通过质谱技术发现1个来自剪接因子(MBL)位点的 circRNA，能够编码蛋白质。最新研究发现，在酵母细胞中circRNA的宿主基因(CNM01190)有2种选择性的剪切产物，可分别对174-aa和252-aa蛋白质进行编码，尤其在转译和碳水化合物代谢过程中发挥重要作用[17]。

1.4 CircRNA的抗病毒免疫反应 近期研究发现，免疫因子NF90/NF110能调节circRNA的生物合成，并通过与病毒中的mRNA相互作用抑制感染。其中免疫因子NF90/NF110是一类与抗病毒免疫相关的反式作用因子，NF90/NF110的相关双链RNA结构域为circRNA生物发生的关键调控因子，促进细胞核中circRNA的产生；其还可与细胞质中的成熟circRNA相互作用。在病毒感染时circRNA的表达逐渐减少，因当体内发生病毒感染时，细胞质中成熟的circRNA被释放出来结合到病毒mRNA上，发挥抗病毒的作用[18]。Wang等[19]研究发现了circRNA在免疫调节和病毒感染中的干预作用，并可用于临床中的抗病毒治疗。

1.5 CircRNA 异常表达的基因组区域 CircRNA-miRNA-mRNA轴是1种经证实的癌症相关通路的调控模式，在癌细胞的发生发展过程中既有激动作用也有拮抗作用。与癌症发生相关的 miRNA多位于敏感位点或多种癌症相关的基因组区域，这些区域是基因突变、染色体易位等遗传物质畸形的好发位点[20]。通过基因测序、基因芯片等相关分析，这些癌症患者的组织中可以检测到许多基因和染色体异常表达的miRNA。而circRNA的表达也会发生相应改变，且circRNA存在于血液、分泌液及组织中，可作为检测癌症的有效生物标志物[21]。例如，白血病等血液相关的恶性肿瘤其根本原因是源于染色体的易位，癌症相关的染色体易位也可以产生线性融合miRNA和融合circRNA(f-circRNA)，二者都涉及癌症的发生和发展[22]。虽然目前还没有研究结果能够说明在神经胶质瘤中circRNA的异常表达与遗传物质改变之间存在确切的联系，但是已证实遗传物质改变可引起 miRNA 的异常表达。但circRNA 的异常表达与癌细胞的发生发展之间的相互关系还需要深入的研究探索。

2 circRNA在神经胶质瘤中的作用

癌症基因组图谱(TCGA)始于2005年，其目的是利用基因组测序和生物信息学对肿瘤基因突变进行精准的编目[23]。为了早期明确诊断、控制疾病进展，并提高胶质瘤患者的治疗效果，必须筛选与神经胶质瘤生物学相关且更有效的生物标志物。目前，与胶质瘤诊疗方面相关的长链非编码RNA(lncRNA)和circRNA 的研究已成为热点话题，可以进一步提供对脑胶质瘤的洞察。基因组分析研究表明：与正常脑组织相比，神经胶质瘤患者的肿瘤组织中存在多种circRNA 的异常表达，不同恶性程度的神经胶质瘤中同1种circRNA的表达程度也不同。因此circRNA 可能在神经胶质瘤的发生、发展中起着一定作用。

2.1 circRNA可调节神经胶质瘤细胞的周期 近无限增殖是肿瘤细胞的重要特征之一[24]。肿瘤细胞的过度表达、增殖在影响细胞周期调节的紊乱中起着重要作用[25]。许多研究表明，circRNA在肿瘤增殖控制中扮演着内源竞争RNA(competing endogenous，ceRNA)的角色。比如，有些circRNA 可影响表皮生长因子受体(EGFR)下游的信号通路，参与了结肠癌、胃癌和肝癌的增殖调控[26]；有些circRNA可以通过靶向参与调控细胞周期的关键分子来调节细胞增殖。p21基因是细胞周期依赖性激酶1(CDK1)家族的成员之一，同时也是细胞周期的负调控因子，且p21靶向诱导细胞周期阻滞并阻止肝癌细胞增殖[27]。目前研究小组在神经胶质瘤的相关研究中发现，若敲除相应的基因可抑制胶质瘤的增殖从而促进其凋亡。Kumar等[28]研究发现，hsa_circ_0046701基因在胶质瘤组织和细胞系中过度表达，若敲出hsa_circ_0046701基因则可抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭；研究进一步表明hsa_circ_0046701基因可通过促进miR-142-3p基因的靶标-ITGβ8(整联蛋白亚基β8)的表达，从而影响神经胶质瘤的增殖和侵袭。因此，进一步证实了hsa_circ_0046701/miR-142-3p/ITGB8环路参与神经胶质瘤的发生、发展。Yang等[29]在神经胶质瘤细胞中发现cZNF292 基因与管腔形成相关。cZNF292基因是重要的环状致癌RNA，在肿瘤管腔形成过程中起重要作用，敲除之可抑制细胞增殖，并通过 Wnt/-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路致使细胞周期停滞。Li等[30]研究发现hsa_circ_0007534基因在胶质瘤组织中高度表达，然而敲除hsa_circ_0007534基因则可抑制神经胶质瘤的发生发展。Zic基因具有锌指结构，是转录因子基因家族的一员，在调节生物生长发育过程中扮演着至关重要的作用。锌指蛋白ZIC5的过度表达促进了人类癌症的发展。ZIC5是miR-761基因的靶标，hsa_circ_0007534基因通过在胶质瘤细胞中抑制miR-761基因来促进ZIC5的表达；研究发现，hsa_circ_0007534基因与ZIC5默契的配合则可抑制miR-761基因的表达，挽救神经胶质瘤细胞的增殖和迁移；并且发现hsa_circ_0007534基因表达水平与胶质瘤晚期肿瘤分级(Ⅲ/Ⅳ)呈正相关。此外，hsa_circ_0007534基因的降解显著抑制了胶质瘤细胞的增殖和迁移，说明circRNA对神经胶质瘤细胞的分化也起一定作用，hsa_circ_0007534/miR-761/ZIC5调控环可能是神经胶质瘤治疗的有希望的治疗靶点。

2.2 circRNA调节神经胶质瘤细胞的凋亡 凋亡的丧失是肿瘤的又一个重要特征。最近的研究发现，一些circRNA参与调控肿瘤细胞的凋亡[31]。Bcl-2家族蛋白在凋亡通路中起着关键作用。抗凋亡蛋白Bcl-2位于线粒体外膜，抑制细胞色素C等凋亡因子的释放，而Bcl-2是miR-143的靶标，circRNA可作为miRNA的海绵在调节凋亡通路中起着关键的作用[32]。Zhang等[33]研究发现，SNF2组蛋白连接子PHD环解螺旋酶的环状形式(circ-SHPRH)可以编码SHPRH-146aa，保护SHPRH免于泛素蛋白酶降解，二者均在正常的人类大脑中广泛存在并高度表达。但在胶质母细胞瘤中呈下调趋势，因此SHPRH-146aa的过表达降低了其在体内恶性行为和致瘤性。circ-SHPRH因具有产生 “UGA”停止密码子的功能，促使SHPRH-146aa的翻译，进一步推测circ-SHPRH和SHPRH-146aa是人类胶质母细胞瘤的肿瘤抑制因子，促进胶质瘤细胞凋亡。

2.3 circRNA参与神经胶质瘤的侵袭和迁移 对于恶性肿瘤而言，侵袭和迁移是不可缺少的特征。上皮间质转换(epithelial interstitial transformation，EMT)在调节许多肿瘤早期侵袭和迁移中扮演着重要角色[34]。在EMT和肿瘤相互作用过程中发现表皮生长因子(FGF)、胰岛素生长因子(IGF)和肝细胞生长因子(HGF)参与其中[35]，同时miRNA也参与了EMT调控。circRNA作为miRNA的海绵，且其具有的特异转录、剪切等调节功能，也可以通过内源性竞争机制参与EMT的调控，从而影响肿瘤的侵袭和迁移。血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)是EMT中重要的血管生成因子[36]，高表达的环状RNA-肌球蛋白轻链肌酶(circRNA-MYLK)在膀胱癌中可以通过将miR-29a结合为RNA海绵来增加VEGFA的 mRNA表达，从而促进肿瘤细胞的迁移[37]。Zheng等[38]研究发现在神经胶质瘤中， 肝细胞核因子1(HNF1)是miR-217的直接靶标，在胶质瘤细胞中发挥致癌作用。而circ-TTBK2是1种仅含有外显子的circRNA基因，由TTBK2基因的外显子3、外显子4、外显子5和外显子6产生，也可以结合并灭活miR-217，通过HNF-1β促进磷脂酰肌醇-3-羟基酶(PI3K)/(蛋白激酶)AKT-ERK通路激活，引发起胶质瘤细胞的攻击，导致肿瘤的恶性程度进一步增高。若敲除circ-TTBK2，则miR-217过表达抑制了体内肿瘤的侵袭、迁移，促进其凋亡。

2.4 circRNA 的特点决定了在神经胶质瘤诊断中的作用 目前多项研究发现，lncRNA和circRNA在神经胶质瘤的发生中起重要的作用，但circRNA与lncRNA不同，circRNA的3′和5′末端未暴露，因此，对核酸外切酶如外切核酸酶不敏感，并且更稳定[39]。研究人员已经从人类细胞中检测出3 001个circRNA[40]，其中显示在控制脑组织和神经胶质瘤中有476个circRNA差异表达[41]。与亲代基因表达相比，circRNA对某些肿瘤具有特异性，且在一些癌症患者的癌组织中高表达。如hsa_circ_0013958在肺腺癌的组织、细胞中上调，同时在血浆中也高表达[42]。由于其本身的结构特点使得circRNA在组织、血清和尿液中更稳定，高通量测序的发展消除了鉴定circRNA的障碍。然而迄今为止，circRNA尚未被临床使用，一个完整可靠的诊断或预后标记标准有待进一步探索，可能为胶质瘤非编码RNA的潜在机制提供了新的线索。

2.5 circRNA可在神经胶质瘤治疗及其预后中贡献出更大的力量 circRNA 的异常表达可以指导神经胶质瘤患者选择不同的治疗方案。替莫唑胺(TMZ)[43]是1种烷化剂，通过攻击肿瘤细胞的DNA诱导癌细胞死亡，是临床上化疗脑胶质瘤的一线常用药物之一，但因其易耐药是导致化疗失败的主要原因。miR-24-3p因子在胶质瘤细胞中过表达，通过下调骨形态发生蛋白3(BNIP3)促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭[44]。最新研究发现， 内皮单核细胞活化多肽Ⅱ(EMAP-Ⅱ)可抑制血管生成促进内皮细胞的凋亡，并能直接促进肿瘤细胞的自噬和凋亡。EMAP-Ⅱ与TMZ结合后降低了miR-24-3p的表达，从而增强了TMZ对体外和体内生殖干细胞(GSCs)的增殖、迁移和侵袭的细胞毒性作用，进一步增强了治疗效果[45]，circRNA在此过程中功不可没。经miR-24-3p(-)、EMAP-Ⅱ和TMZ联合治疗，最终表现出肿瘤的低恶性度和最长的生存率。研究发现EMAP-Ⅱ还可促进肿瘤坏死因子受体1(TNF-R1)的凋亡，从而发挥抗肿瘤的功能[46]；并且还增加了血脑屏障的渗透性，进一步促进了肿瘤的凋亡。EMAP-Ⅱ在临床实践中具有良好的应用前景，除此之外，最近的证据表明circRNA在组织发育、基因调控和癌变过程中起着重要的作用。内源性circRNA在人体细胞中编码功能蛋白，而circ-FBXW7基因和FBXW7-185aa基因对脑胶质瘤有潜在的预后影响，可作为神经胶质瘤治疗靶点，用于抗神经胶质瘤治疗[47]。其他circRNAs，如circMTO1，hsa_circ_001395，circUBAP2，circCCDC66，circGFRA1，hsa_circ_0004277和hsa_circ_0005986也是癌症诊断和预后有价值的标志物。但是要将这些基础研究真正用于临床诊疗还有漫长的过程，需要解决高效、特异性的载体等一系列问题。

3 展望

circRNA 是RNA领域的研究热点，随着基因芯片的问世，更进一步促进了circRNA在癌症领域中的探索。现经证实，circRNA在哺乳动物中广泛存在，可通过竞争抑制、可变剪接、转录调控、编码蛋白、抗病毒免疫反应、miRNA海绵作用等功能，在神经胶质瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭等方面发挥重要作用。因circRNA 特异的闭合环状结构决定了它调控的复杂性，因此需进一步研究挖掘circRNA在神经胶质瘤发生发展中的其他功能。由于其稳定性较高，可在组织、血清和尿液中检测，若应用于临床，可为胶质瘤的诊疗提供新的线索及理论依据。

circRNA在神经胶质瘤等癌症领域及抗病毒免疫中发挥重要作用，但在遗传病、免疫源性疾病等其他领域未见详细报道。因此，寻求其他疾病相关作用机制具有重大临床意义。目前，circRNA仍处于研究初期，需要通过进一步的研究找出神经胶质瘤发生、发展关键阶段的相关特异circRNA，确定它们的作用机制，通过基因芯片技术，将这些 circRNA 真正用于神经胶质瘤诊疗、预防中，实现精准化及个体化诊疗，避免神经胶质瘤过度诊疗。