小球藻对南美白对虾生长性能及免疫功能的影响

■崔青曼 吴佩佩 张 旭 蔡凡帆 袁春营

（天津市海洋环境保护与修复技术工程中心天津市海洋资源与化学重点试验室天津科技大学海洋与环境学院，天津300457）

南美白对虾（Litopenaeus vannamei），俗称白肢虾，属于节肢动物门(Arthopoda)、甲壳纲(Crustacean)、十足目(Decapoda)、游泳亚目(Natantia)、对虾科(Penacidae)、对虾属(Penaeus)，Litopenaeus亚属，为广温广盐性热带虾类，是世界养殖产量最高的三大优良品种之一。1988年，中国科学院海洋研究所从美国夏威夷引进中国，早已在全国广泛养殖。但是最近几年来，对虾病害频发，对虾养殖成功率明显降低，给养殖户造成较大经济损失。由于抗生素之类的药物已受到严格控制，国内外学者和养殖户把目光聚焦在免疫增强剂上，希望通过提高对虾机体免疫力，增强对虾抵抗病害和应激的能力，提升对虾养殖成功率和养殖水平[1-5]。

小球藻为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是地球上最早的生命之一，适应能力强，分布广，生长速度快，生物量大[6]，其蛋白质含量高（50%以上），被作为优良的蛋白质来源[7]。小球藻还含有脂类、碳水化合物、多糖和叶绿素等多种营养成分，是营养全面的食品[8]，小球藻所特有的促生长因子能促进生物的生长，提高生产性能，增加机体免疫力，降低饲料消耗，小球藻细胞中含有的“酸性多糖体”可诱使生物体产生大量的干扰素，干扰素会刺激机体免疫功能，大大增强抗病能力[9]。用小球藻作为饲料添加剂，在鲫鱼、三疣梭子蟹水产动物上取得良好效果[10-11]。何亚丁等[12]研究了小球藻藻渣替代豆粕对凡纳滨对虾生长性能和氮磷排放的影响，小球藻藻渣可以部分替代凡纳滨对虾饲料中的豆粕，当其用量为11%时，可使豆粕的用量从19%降至10%而不影响凡纳滨对虾的生长和氮排放，并降低磷排放。本文在饲料中添加小球藻，通过测定系列指标，探讨其对对虾生长及免疫功能的影响，为实现南美白对虾养殖业的可持续发展开辟一条新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小球藻购自上海光语生物科技有限公司。试验用南美白对虾购自天津鑫永丰水产养殖有限公司，体长（6.14±1.39）cm，体质量为(4.26±1.71)g。副溶血弧菌为天津市病害防治中心友好赠送。超氧化物歧化酶（SOD）、酚氧化酶（PO）、一氧化氮合酶（NOS）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

试验饲料为自行配制，基础配方见表1。饲料原料经粉碎后过80目筛，各原料按配比定量后混合均匀，然后加入适量的水揉匀，经双螺杆挤条机挤压出直径为1.0 mm粒径的饲料，60℃烘干后剪切成1.5 mm长的颗粒贮存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

试验设置3个小球藻组，添加剂量分别为0.5%、1%和2%小球藻分别替代基础饲料中的国产鱼粉，1个对照组，每组设3个平行，共计12个处理组。水族箱规格720 mm×490 mm×380 mm，每个水族箱中投放40只对虾。

1.2.2 饲养管理

整个饲养试验持续4周，投饵量按照对虾体重的4%～6%进行投喂，每天投喂4次，投喂时间：6:00、11:00、16:00和21:00，各时间点投喂量占日总投饵量的比值分别为30%、20%、30%和20%。饲养期间连续充气，水温27～29 ℃，盐度18～20，pH值7.8～8.1，溶解氧＞6 mg/l。

表1 饲料基础配方

1.2.3 对虾生物学指标测定

4周养殖试验结束，分别对每个处理组对虾进行计数、称重，计算对虾的存活率及特定生长率。

存活率(%)=Nt/No×100

特定生长率（%/d，SGR)=100×(LnMt-LnMo)/t

式中：No、Nt——分别为每个重复对虾初始尾数和终末尾数(只)；

Mo、Mt——分别为初始体质量和终末体质量(g)；

t——试验天数(d)。

1.2.4 对虾非特异性免疫指标测定

1.2.4.1 血清的制备

用l ml的无菌注射器，从每个处理组中随机取出15～20只虾，腹窦部位取血，置于离心管中，4℃条件下，3 500 r/min离心10 min，上清液即为南美白对虾血清，用于指标测定。

1.2.4.2 肝胰腺组织匀浆的制备

将抽取血液后的对虾解剖，取出肝胰腺，置于5 ml离心管中，冰浴条件下，加入9倍体积0.05 mol/l、pH值6.5的磷酸盐缓冲液（PBS0），组织匀浆器中进行匀浆，匀浆液经3 000 r/min离心15 min，上清液即为10%肝胰腺组织匀浆液，取匀浆液少许，按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书，测定匀浆液中可溶性蛋白质浓度，其余的4℃保存，用于后续指标测定。

1.2.4.3 超氧化物歧化酶活性

南京建成生物工程研究所试剂盒测定SOD的活性。血清中SOD活力单位定义：每毫升反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为一个SOD酶活单位（U）；肝胰腺中SOD酶活力单位定义：每毫克蛋白质中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为一个SOD酶活单位（U）。

1.2.4.4 一氧化氮合酶活性

南京建成生物工程研究所试剂盒测定NOS活性。血清中NOS酶活单位定义：每毫升血清每分钟生成1 nmol一氧化氮为一个酶活力单位（U）；肝胰腺中NOS酶活单位定义：每毫克组织蛋白质每分钟生成1 nmol一氧化氮为一个酶活单位（U）。

1.2.4.5 酚氧化酶活性

参照南京建成生物工程研究所对虾酚氧化酶酶联免疫检测试剂盒说明书进行。应用双抗体夹心法测定样品中对虾酚氧化酶水平，标准曲线计算样品中对虾酚氧化酶的活性。

1.2.4.6 溶菌酶活性

南京建成生物工程研究所试剂盒测定LZM活性。测定原理：在一定浓度的混浊菌液中，由于LZM能水解细菌细胞壁上的肽聚糖使细菌裂解，体系浓度降低，透光度增强，根据透光度变化推测LZM含量（1 μg=80 U）。

1.2.4.7 酸性磷酸酶活性

南京建成生物工程研究所试剂盒测定ACP活性。血清中ACP酶活单位定义：100 ml血清在37℃下，与基质作用30 min，产生1 mg酚为1个金氏单位；肝胰腺中ACP酶活单位定义：每克组织蛋白质，37℃下与基质作用30 min，产生1 mg酚为1个金氏单位。

1.2.4.8 碱性磷酸酶活性

南京建成生物工程研究所试剂盒测定ALP活性。血清中ALP酶活单位定义：以100 ml血清在37℃与基质作用15 min，产生1 mg酚为1个金氏单位；肝胰腺中ALP酶活单位定义：每克组织蛋白质，37℃下与基质作用15 min，产生1 mg酚为1个金氏单位。

1.2.4.9 总抗氧化能力

南京建成生物工程研究所试剂盒测定T-AOC。T-AOC用FeSO4标准溶液的浓度来表示。血清T-AOC定义：与血清的测定OD值相同的FeSO4标准溶液的浓度，单位为mmol/l，肝胰腺T-AOC定义：与每克肝胰腺蛋白质测定OD值相同的FeSO4标准溶液的浓度，单位为mmol/g prot.。

1.2.5 攻毒试验

投喂28 d后，对4个处理组剩下的对虾各取12只进行攻毒，第3腹节肌肉注射副溶血弧菌菌株菌悬液（1.6×108cfu/ml)0.1 ml，对照组注射相同剂量的生理盐水，记录接种7 d后各组对虾的累积死亡率。

1.2.6 数据处理与分析

各处理组数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 小球藻对南美白对虾生长及存活率的影响

试验结束后，统计各处理组死亡只数，测定各存活对虾体质量，计算存活率和特定生长率，结果见图1和图2。添加小球藻的对虾存活率明显高于对照组，以1%添加组最高，为91.67%，2%添加组次之，为90.83%，对照组最低为83.33%，各饲喂组之间对虾存活率没有显著性差异（P＞0.05）；饲喂2%小球藻的南美白对虾的特定生长率最大，为4.84%，其次为1%添加组，为4.76%，对照组最低为3.38%，2%和1%小球藻添加组对虾的特定生长率显著高于对照组（P＜0.05）。由此可见，小球藻能够提高南美白对虾的存活率和特定生长率，综合考虑，以1%的添加量最适宜。

2.2 小球藻对南美白对虾血清非特异性免疫指标的影响(见表2)

由表2可知，1%和2%小球藻添加组的南美白对虾血清中SOD、NOS、PO、LZM、ACP和ALP活性及T-AOC含量均显著或极显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01），0.5%添加组的南美白对虾血清中的部分酶活（PO、LZM、ALP）显著高于对照组（P＜0.05），其他酶活和总抗氧化能力高于对照组，但未达显著性差异（P＞0.05）。

图1 不同处理组凡纳滨对虾的存活率

图2 不同处理组南美白对虾的特定生长率

2.3 小球藻对南美白对虾肝胰腺非特异性免疫指标的影响(见表3)

表2 不同处理组对虾血清中非特异免疫指标的影响

表3 不同处理组对虾肝胰腺中非特异免疫学指标的影响

由表3可知，1%和2%小球藻添加组的南美白对虾肝胰腺中SOD、NOS、PO、LZM、ACP和ALP活性及T-AOC含量均显著或极显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01），0.5%添加组南美白对虾肝胰腺中的酶活（SOD除外）和T-AOC含量均显著高于对照组（P＜0.05），SOD的酶活高于对照组，但未达显著性差异（P＞0.05）。

2.4 小球藻对南美白对虾攻毒死亡率的影响(见图3)

从图3看出，与对照组比较，饲喂小球藻饲料的对虾死亡率明显降低，0.5%添加组的死亡率为63.16%，1%添加组的死亡率为52.63%，2%添加组的死亡率为47.37%，而对照组的死亡率为73.68%，可见，小球藻可以提高南美白对虾的机体免疫功能，从而降低攻毒死亡率。

3 讨论

3.1 小球藻对南美白对虾生长的影响

张玲等[13]经过分析小球藻Chlorella sorokiniana C74的营养素，发现Chlorella sorokiniana C74含有丰富的营养物质，粗蛋白质、多糖、油脂、灰分、粗纤维和色素分别占藻粉干重的20.4%、34.28%、22.16%、12.20%、20.22%和4.50%；含有多种不饱和脂肪酸，其中亚油酸和亚麻酸含量分别为22.73%和14.87%；氨基酸含量为17.50%，其中必需氨基酸为6.17%，通过必需氨基酸指数评价，指出该小球藻是一种优质的蛋白来源。小球藻的保健功能自从被开发出来，已在许多领域得到广泛的应用。小球藻蛋白质含量高，营养成分齐全，在饲料中添加适量的小球藻能提高猪、肉鸡和蛋鸡的生产性能，改善鸡蛋色泽，提高畜禽产品的品质，明显增加银鲫的体重，降低饲料系数[14]。本研究发现，小球藻能够显著促进南美白对虾生长，为一种良好的对虾饲料添加剂。

图3 副溶血弧菌攻毒后不同处理组南美白对虾的死亡率

3.2 小球藻对南美白对虾免疫功能的影响

甲壳动物缺乏特异性免疫因子，主要以非特异性免疫抵御病原体的侵袭，包括血细胞的吞噬、包囊、凝集及血清和肝胰腺中酚氧化酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶等免疫因子的作用。有学者认为，酚氧化酶以酶原形式存在于甲壳动物血细胞中，血细胞受刺激后将该酶原释放到血淋巴中，并被激活表现出活性，它与血细胞的吞噬、包囊以及血淋巴的抗菌活性和外源物质的识别有关[15]；超氧化物歧化酶在清除自由基、防止生物损伤方面起十分重要作用，可作为衡量甲壳动物免疫状态的指标之一；溶菌酶是一种碱性蛋白，能水解革兰氏阳性菌细胞壁中的乙酰氨基多糖，破坏和消除侵入体内的异物，从而担负起机体防御的机能；碱性磷酸酶和酸性磷酸酶是动物溶酶体酶的重要组成部分，在免疫反应中发挥重要作用，不仅能催化磷酸单酯水解，还直接参与磷酸基团的转移；总抗氧化能力是反映机体抗氧化作用的重要指标之一。本研究通过在饲料中添加1%小球藻，发现小球藻能够显著或极显著提高对虾血淋巴和肝胰腺中的SOD、NOS、PO、LZM、ACP、ALP酶活和T-AOC含量，明显降低对虾的攻毒死亡率，从而明显提高南美白对虾的养殖存活率。