骨肉瘤干细胞的研究进展

张静 樊根涛 杨进 周光新

骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS ) 是儿童和青少年中最常见的骨肿瘤类型，也是该人群癌症相关死亡的第二大原因。大多数 OS 起源于长骨，如股骨远端和胫骨近端。它具有高度侵袭性，转移率约为 20%，最常转移至肺或其它部位的骨骼。OS 的起源尚不清楚，大多学者认为其起源于未分化的间充质干细胞 ( MSC ) 或更定向的骨祖细胞[1]。目前，临床上多采用手术和化疗相结合的方式治疗 OS，几乎所有患者均接受新辅助静脉注射联合化疗 ( 多柔比星及顺铂，伴或不伴甲氨蝶呤 ) 作为初始治疗。临床管理的进步导致 OS 患者的 5 年生存率显著提高，其 5 年生存率在大多数治疗中心已超过 50%。然而，转移性和复发性 OS患者的生存率并没有得到改善，生存率仍在 20%～30% 以下[1-2]，这表明迫切需要更好地了解这种疾病，以期能够找到更好的治疗方法。

揭示癌症的起源一直是一个备受关注的话题，因为它可能揭示完全治疗癌症的方法。在过去的 20 年中，大量研究表明只有小部分具有肿瘤起始能力的癌细胞是肿瘤发生的核心起源，这一癌细胞亚群被命名为肿瘤干细胞( CSCs )。CSCs 具有正常干细胞的一些特征，它们可以通过细胞分裂自我更新以形成相同的子细胞并分化成各种类型的子代[3-4]。早期对 CSCs 的研究一直致力于验证某些类型癌症中 CSCs 的存在，并寻找分离 CSCs 的分子标记。在概念性提出存在 CSCs 几年后，研究人员首先在白血病模型证实了 CD34+CD38-白血病细胞具有骨髓造血干细胞特征[5-6]。乳腺癌 ( CD44+CD24-/ lowLin-) 中首次鉴定出实体肿瘤 CSCs[7]，随后其它包括脑癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、皮肤癌和肺癌等常见肿瘤中亦鉴定出 CSCs 的存在，并提出了针对肿瘤的常见或独特的 CSCs标记物[8]。目前，人们普遍认为 CSCs 与肿瘤的病理特征密切相关，导致更差的临床预后。对常规抗癌疗法的抗性是 CSCs 的特征，CSCs 具有抵抗放射和化疗的内源性抗性机制，这使得 CSCs 比分化后的细胞更具有生存优势[9-10]。此外，CSCs 可导致肿瘤组织中细胞的不同组成，从而导致表型变化的亚克隆的产生，从而增加在抗癌治疗后留下抗性级分的机会[11]。因此，针对 CSCs 的靶向治疗有望成为治疗恶性肿瘤的重要策略。

一、OS 中 CSCs 的发现

CSCs 通常比分化的癌细胞更恶性，并且能够绕开针对肿瘤的常规治疗。证据表明，OS 患者在第一次治疗完成几十年后仍可能出现远处转移[12]，这可能进一步突出了CSCs 的致瘤特征。Gibbs 等[13-14]首先证实了骨肉瘤肿瘤干细胞 ( OSCs ) 的存在，他们发现了人 OS 组织样本和细胞系中能够在无血清条件下生长肉球或骨球的细胞亚群。Martins-Neves 等[15]随后鉴定了 MNNG / HOS 骨肉瘤细胞系中的细胞亚群，这些细胞表现出对化疗和辐射的治疗抗性，并表现出干细胞样特性。支持 OSCs 存在的其它体外研究还有在非贴壁条件下 MG63 细胞的肉球形成[16]以及人和犬 OS 中 OSCs 的分离和鉴定[17]。此外，OS 中还分离出了侧群 ( SP ) 细胞。与非 SP 细胞相比，SP 细胞的球体形成、集落形成及致瘤性更高[18]。Yang 等[19]的研究也证实 SP 细胞具有自我更新的能力。

二、OSCs 的分离技术

1. 侧群细胞 ( 染料外排试验 )：CSCs 的一个主要特征是它们有逃避治疗的潜力，该特征与 ATP 结合盒 ( ABC )多药外排转运蛋白如 MDR1 / ABCB1 和 BRCP1 / ABCG2 和ABCB5 的表达增高有关。基于这一特性，通过荧光激活细胞分选，测量细胞排除 DNA 结合染料 ( Hoechst 33342或 Rhodamine 123 ) 的能力可用于 CSCs 鉴定[20-21]。高表达ABC 转运蛋白的细胞不含染料，在分析过程中可视为“侧群 ( Side population，SP )”。SP 细胞表现出高水平的多药耐药性，并与 CSCs 有相似之处[18]。Hoechst 染料排除分析是分离耐药细胞从而建立 SP 细胞的常用方法。与非 SP 细胞相比，SP 细胞的下游分析显示，ABC 转运体，Oct4，Nanog 基因等表达上调，球体形成增加，对阿霉素、甲氨蝶呤和顺铂的多药耐药性更高[19,22]。

2. 保留染料试验：PKH26 是一种标记 SC 膜的红色荧光染料，染色速度快，性质稳定，并且无细胞毒性[23]。它能够与细胞膜脂质区稳定结合并发出红色荧光，均匀地标记在细胞膜上，并能在细胞分裂时平均分配至子代细胞内，从而在分裂快的细胞中被稀释，而保留在分裂慢的细胞中。因此，由于 CSCs 不对称分裂的特性，静止期的CSCs 可长期保留标记。这种特性已被用来在 OS 细胞系中分离 pkh 阳性细胞[24]。这一特性也可以解释 OSCs 对大多数针对快速分裂细胞的抗癌药物的耐药性，并可能解释以后的复发。了解 OS 异质性有助于设计结合细胞毒性药物和选择性靶向 CSCs 的药物的改良治疗方法。

3. 醛脱氢酶 ( ALDH )：另一经常使用的方法是检测药物解毒酶 ALDH 的表达和活性。Honoki 等[25]检测出 ALDH1 高表达的 MG63 细胞亚群，进一步研究显示ALDH1 高表达的细胞干细胞样基因 ( Nanog，Oct3 / 4，Stat3，Sox2 ) 的表达也相对增加，对多柔比星和顺铂具有更高抗性，同时其球体形成能力增加，提示其自我更新能力增加。Wang 等[26]在 OS 细胞系 OS99-1 中的研究验证了这一点。重要的是，其后 Greco 等[27]在人 OS 样本中也检测到 ALDH 高表达细胞，并且发现 ALDH 活性的增加与转移潜能相关。此外，使用双硫仑抑制 ALDH 活性导致细胞增殖减少，表明其直接靶向 CSCs 表型细胞。与ALDH 低表达细胞相比，ALDH 高表达的细胞在体内更具致瘤性并且干细胞样基因表达 ( Nanog，Sox-2，Oct3 / 4 )更高。与此一致，Lu 等[28]发现与致瘤性较差的 OS 细胞系 ( 如 U2OS，MG63 和 Saos-2 ) 相比，高致瘤性 OS 细胞系 ( ZOS，ZOSM 和 143B ) 具有更高比例的 ALDH 高表达细胞。

4. 细胞表面标志物：细胞表面标志物可以说是最具吸引力和最受追捧的 CSCs 鉴定方法，如 CD133 等，通常用于鉴别 CSCs。Gemei 等[29]通过基因表达谱检测了 245 种膜蛋白，其中 OSCs 与分化细胞间差异表达的蛋白有 50种。其结果为确定 OSCs 的细胞表面蛋白质特征提供了有价值的数据。专门针对 CSCs 而非正常细胞 ( 包括干细胞 )的特定细胞表面标记物将极大地简化这些细胞的分离和治疗潜力。

CD133 ( prominin )：CD133 ( Ac133 ) 是 prominin 基因的家族成员，是一种具有 3 种异构体的糖蛋白，被广泛用于分离 CSCs。一些研究已经将 CD133 阳性细胞与干细胞表型联系起来。包括 CD133 阳性细胞群展现的 SAOS2、MG63 和 U2OS 骨肉瘤细胞株中的干细胞样特性[30-32]；干细胞特性基因 Oct4、Nanog 和 CXCR4 的 mRNA 表达水平升高[33]；肺转移中更高的迁移和侵袭能力[34]以及更高的耐药性[35]。最近 Xie 等[36]采用免疫组织化学的方法检测了 28 例 OS 和 21 例骨软骨瘤中 CD133 的表达水平。结果显示，CD133 蛋白在 OS 组织中的阳性表达率明显高于骨软骨瘤组织 ( 60.7% 与 19.0% )，其在 OS 中的表达与Enneking 分期及远处转移密切相关，可能是 OS 患者预后不良的潜在预测指标。

CD117 ( c-kit )，Stro-1：CD117 和 Stro-1 均为 MSC 的标志物。Adhikari 等[37]研究发现，它们优先表达于球状及阿霉素耐药性 OS 细胞中，小鼠和人 OS 细胞系以及原代培养物中均分离鉴定出 CD117 / Stro-1 双阳性细胞，且双阳性细胞表现出更高的球体形成能力、侵袭性、转移潜能及耐药性，并富含转移相关标志物 CXCR4 和耐药标志物ABCG2。此外，双阳性细胞更容易在较低的细胞数下形成肿瘤，并且与双阴性细胞相比，该 CSCs 组分转移潜能增加。后续研究证实了这些发现[38-40]，证明了 CD117 和Stro-1 作为鉴定和分离 OSCs 的分子标记物的重要性。

CD271：CD271 是一种神经嵴神经生长因子受体，也是骨髓 MSC 的标志物。Tian 等[41]研究 CD271+细胞的干样表型。人 OS 组织中可见 CD271+细胞，MNNG / HOS、U2OS、Saos2 细胞系中也含有 CD271+亚群。作者进一步发现 CD271+OS 细胞显示出 CSCs 的大部分特性，例如体内的自我更新、分化、抗药性和致肿瘤性。与 CD271-细胞相比，Nanog、Oct3 / 4、STAT3、DNA-PKcs、Bcl-2 和ABCG2 在 CD271+细胞中表达更多。该研究支持 OS 中含有 CSCs 的假说，并在一定程度上揭示了维持 CSCs 特性所涉及的可能机制之一。

5. 球体形成实验：研究人员已经通过细胞形成球体的能力鉴定了组织干细胞，并且使用这种方法评估 CSCs 的存在。肉瘤球 ( 由肉瘤细胞生长的球体 ) 可以在非黏附、无血清的条件以及用生长因子 ( N2、表皮生长因子等 ) 补充培养基的实验设置下生长。

Gibbs 等[13]于 2005 年首先使用球体形成实验分离出OSCs。Fujii 等[16]进一步表明球形细胞在免疫缺陷小鼠中具有致瘤性，并且这些细胞具有更强的耐药性，提示CSCs 表型。Martins-Neves 等[15]对 MNNG / HOS 细胞的球体形成率进行了详细的研究，结果显示从球体中分离的细胞具有 MSC 特性，包括干细胞基因 Oct3 / 4、Nanog 和ABC 转运体的基因表达增加，并且球形细胞对化疗和辐射具有更强的抵抗力，并且与亲代细胞相比，这些细胞在体内具有更高的致癌性。该课题组随后对同一样本采用几种不同的 CSCs 富集方法[42]，实验数据表明，具有特定分子和功能特征的 CSCs 根据其所选用的方法而富集，因此异质性 CSCs 亚群可以同时存在于同一癌细胞系中，表明在OS 的 CSCs 群体中可能存在异质性。

6. 化疗诱导：在难治性肿瘤患者中，存在一种耐药的肿瘤细胞亚群，因此，有研究探讨了经化疗或治疗耐药的细胞中是否可能含有 CSCs。Tang 等[40]的研究结果显示经甲氨蝶呤预处理或耐药的细胞不仅表达 CD117+/ Stro-1+，而且在体外形成更多的球体，并且在皮下注射免疫缺陷小鼠时更易致瘤。因此，他们认为化疗富集是一种可行的、实用的 OSCs 富集方法。Yu 等[43]最近在顺铂耐药的 143B和 U2OS 细胞中的研究也证实了这一点，他们发现通过活化的 Notch 信号通路可以富集具有 CSCs 特性的细胞。这些研究结果表明 CSCs 表型可以通过化疗诱导，而不同的化疗诱导是否会导致不同的 CSCs 亚群仍有待确定。

二、影响 OSCs 的信号通路

转录因子 Oct3 / 4、Sox2 和 Nanog 在多种肿瘤 CSCs 的发生和未分化胚胎干细胞多能性的维持和自我更新中起着重要作用[44-49]。Levings 等[50]构建了稳定表达人 Oct4 启动子驱动的 GFP 报告基因的骨肉瘤细胞系，其致瘤性明显高于去除 GFP 的细胞。Oct4 / GFP+细胞也表达 MSC 标记物 CD105 和 ICAM-1，并有向肺转移的倾向。Sox2 在人和小鼠骨肉瘤细胞系及组织标本中均有高表达。Sox2 的敲除导致骨肉瘤细胞分化增加，克隆形成、迁移和侵袭减少，同时激活 Wnt 通路，从而抑制肿瘤的形成。相反，缺失Sox2 的骨肉瘤细胞不能形成骨球并分化为成熟的成骨细胞[51]。这些观察结果得到了 Tang 等[52]的证实，他们的实验结果表明 Oct4 和 Sox2 的过度表达导致骨肉瘤细胞系中肿瘤干细胞的富集。关于 Nanog 在骨肉瘤中的作用知之甚少，但研究表明它可能靶向 CSCs[53]。在骨肉瘤细胞系中添加 HDAC 抑制剂丙戊酸 ( VPA ) 和去甲基化剂，5’-氮杂胞苷 ( DAC ) 可诱导包括 CD133，Oct4，Sox2 和 Nanog 在内的干细胞标记物的表达增加，并且增加了对肉球和集落形成效率的能力[54]。而二甲双胍的使用则下调多能性调节因子 Oct4，Sox2 和 Nanog 的表达，并降低球体的自我更新能力[55]。

转化生长因子-1 ( TGF-β1 ) 是一种促进肿瘤增殖和细胞因子分泌的多效性细胞因子。TGF-β1 信号转导与缺氧环境结合可显著诱导无干细胞骨肉瘤细胞的自我更新，并增强 OSCs 的转移潜能、耐药能力、成瘤性和新生血管生成能力[39]。提示骨肉瘤细胞可能通过分泌转化 TGF-β 来维持骨髓基质干细胞的生长，促进前肿瘤细胞因子的产生[56]。TGF-β1 的作用还与未成熟或未分化细胞中 Sox2 的表达及 Nanog 和 Oct4 的表达略微增加有关[39]。

丝裂原活化蛋白激酶 ( MAPK ) 在 OS 细胞的增殖、分化、运动和存活等过程中起着重要的作用，有研究表明其可能影响 OSCs 的表型：MAPK 信号通路与骨肉瘤细胞侵袭过程中的细胞骨架重排有关，并且 ERK / MAPK 通路与参与了 OSCs 侵袭性和运动性的增强的差异表达蛋白有关[29]。

Notch 蛋白是由相邻细胞上的配体激活的跨膜受体。激活后，Notch 胞内结构域 ( NICD ) 被释放并进入细胞核，在那里调节 Hey 和 Hes 家族蛋白的表达。Notch 信号通路参与了干细胞的维持[57]。Notch 信号的失调导致了骨肉瘤的发生，证明了 Notch 信号通路在骨肉瘤的发生和发展中的意义[58]。此外，Notch 诱导的骨肉瘤细胞系在裸鼠体内形成侵袭性高级别肿瘤；Notch 激活的突变作为 p53 丢失驱动的骨肉瘤模型的第二次打击，显著缩短了肿瘤的潜伏期和侵袭性[59]。同时，抑制 Notch 信号后，小鼠骨肉瘤细胞模型的侵袭性转移表型和 ALDH 活性均降低。这一发现提示 Notch 信号通路可能通过抑制 ALDH 而影响 OSCs。Hedgehog 通路已被证明参与调节多种肿瘤的 CSCs[60-61]，并且有证据表明该通路参与了 OSCs 的启动和调节[62]。

Wnt / β-catenin 或典型 Wnt 信号通路调节 CSCs 的自我更新，参与肿瘤进展和化疗抵抗。Martins-Neves 等[63]最近的研究显示：Wnt 信号通路的破坏削弱了 OSCs 的相关性状，Wnt 信号通路的抑制导致骨肉瘤球对阿霉素的化学敏感性提高。这些数据表明 Wnt / β-catenin 信号是骨肉瘤潜在的治疗靶点，并为传统化疗结合该信号通路的特异性靶点提供了基础研究证明。

二、针对 OSCs 的靶向治疗

CSCs 利用各种机制来解除凋亡信号通路的调节，包括进入静止状态和减慢增殖速度的能力[64]。这可以与ABC 药物外排转运蛋白的过度表达相结合以增强化疗抗性[65]。药物外排转运体的抑制可促进 OSCs 对阿霉素的摄取并启动细胞凋亡，而药物转运蛋白 P-糖蛋白和乳腺癌相关蛋白的外排活动可促进 OSCs 进入静止状态[66]。

抗癌药盐霉素已被证明是 OSCs 在体内和体外的有效抑制剂[52]。盐霉素抑制 OSCs 中 Oct4 和 Sox2 的表达，抑制其成球能力及化疗抗性，并且没有严重副作用。盐霉素还可抑制 Wnt 通路活性，提示 Wnt / β-catenin 信号通路参与盐霉素的抑癌作用。Ni 等[67]采用乳化 / 溶剂蒸发法制备了与 CD133 适配体偶联的载盐霉素的乳酸聚乙烯醇酸共聚物纳米颗粒 ( Ap-SAL-NP )，研究证实其对 CD133+的OSCs 具有很好的杀伤作用。其后该课题组研究了能够同时靶向 OS 细胞和 CSCs 的 EGFR 适配体偶联的载盐霉素聚脂杂化纳米颗粒 ( EGFR-SNPs )[68]及更进一步的包埋盐霉素的 EGFR / CD133 双配体聚脂纳米颗粒 ( CESP )[69]，实验结果提示 CESP 在 OS 细胞和 CSCs 中的细胞毒性优于单靶向或非靶向盐载纳米颗粒，证明由于癌细胞和 CSCs 之间的自发转化，同时靶向 CSCs 和癌细胞对于实现优选的癌症治疗功效至关重要。

蟾蜍灵是中药蟾酥中的有效成分，蟾蜍灵处理来自MG63 细胞系的 OSCs 可以导致球体不能贴壁分化，此时细胞稳定表达 CD133 和 OCT-4 提示允许分化的条件。蟾蜍灵在非贴壁培养体系中也可抑制球体单细胞再次形成球体，在这些细胞中也检测到增殖标志物 Ki67 的表达降低。该数据提示蟾蜍灵可抑制 CSCs 的增殖和分化[70]。他们的进一步研究提示[71]，蟾蜍灵可能通过调节 mir-148a起到抑癌作用。BRM270 是从 7 种中药 ( 包括三白草、紫草、黄芩、柑橘、马齿苋、寻常紫菜属和芦荟 ) 组成的药方中提取出的有效成分，被证明可以抑制不同癌症类型的肿瘤细胞增殖。Kwon 等[72]和 Mongre 等[73]提出其抑制CSCs 的 NF-κB 信号级联反应可能是其抑癌机制。此外，片仔癀可明显抑制人 OSCs 裸鼠移植瘤的生长．且能够增强阿霉素的作用，其作用机制与抑制膜转运蛋白 ABCB1、ABCG2 的表达相关[74]。

生态位是干细胞所处的环境，并且负责维持独特的干细胞特性如自我更新和未分化状态。构成生态位的异质群体包括干细胞和周围分化的细胞。这种异质性网络负责控制确定干细胞命运的必要途径。CSCs 存在于其独特的生态位中的概念正在迅速发展，理解和识别在这种环境中发生的过程非常重要。这种 CSCs 群体用于维持自我更新和分化能力的必要内在途径被认为是 CSCs 所处环境的结果。特定 CSCs 生态位提供这种群体蓬勃发展的环境的能力是癌症生物学的一个关键方面，需要进行深入研究[75]。通过在微环境内提供适当的信号，诸如炎症、上皮至间充质转变、缺氧和血管生成的稳态过程有助于维持和控制CSCs 命运[76]。与 OSCs 生态位功能相关的信号通路可能为 OS 的治疗提供新的靶点：研究表明 Hedgehog 和 Notch通路参与血管周围生态位，VEGF / VEGFR 和 SDF-1 /CXCR4 参与 GSC 生态位中的血管生成和内皮重编程。因此，抗 VEGF 和 CXCR4 可抑制肿瘤血管生成，并可能打破血管周围生态位[77]。

TSSC3 是一种主要由甲基化调控的印迹基因。OSCs中 TSSC3 的表达显著低于分化的 OS 细胞，相反，TSSC3的过表达可增加 OSCs 的凋亡并抑制其耐药性[38]。这些结果表明，OS 中 TSSC3 的表达可被去甲基化药物所靶向。MST312[78]和咖啡因分别是端粒酶和 DNA 修复抑制剂，表明它们也可能是 OSCs 靶向治疗的候选物[16]。端粒酶是恶性肿瘤细胞永生化的部分原因，端粒酶活性升高与OSCs 的自我更新和化疗耐药有关[66]；咖啡因增强了阿霉素和顺铂的疗效，表明肉球细胞的耐药性与 OSCs 的 DNA修复能力相关。其它潜在治疗药物包括表观遗传调节剂( 5-氮胞苷 )、抗微管药物 ( 长春新碱 ) 和端粒酶抑制剂( RHPS4 ) 等[79]。

三、小结与展望

CSCs 与恶性肿瘤的发生、复发、耐药性、侵袭和转移密切相关。因此，OSCs 的靶向治疗为 OS 的治疗提供了一种有前景的策略。然而，这样的治疗需要准确识别和分离 OSCs。目前，OSCs 最有效的标志物是 CD133、CD117、Stro-1 和 ALDH，然而仍然缺少能够特异性分离OSCs 的明确标志物。将 CSCs 标记与成球分析和 SP 细胞分选相结合，可提高 OSCs 分离的效率和准确性。然而，球形细胞和 SP 细胞并非完全由 CSCs 组成，导致细胞类型重叠[77]。因此，为了准确地从非 OSCs 中分离出 OSCs，还需要进一步深入研究 CSCs 标记的生物学功能。此外，肿瘤细胞可以从干细胞表型中来回切换，进一步增加 CSCs假说的复杂性，并提示环境压力 ( 实验或患者中 ) 可能是异质性和可塑性的触发因素。例如，通过化疗治疗增加的环境压力有可能诱导 OS 从已分化向干细胞样表型的转换[43,80]。这种潜在的可塑性和许多不同的实验富集方法可能有助于了解不同研究报告的 CSCs 标记的变化。重要的是，似乎富集的 CSCs 表型可能取决于应用的分离方法，然而，需要更多的研究来验证这一点。为了开发靶向CSCs 的新疗法，CSCs 活动中的关键信号通路越来越受到关注。然而，相对较少的研究集中在 OSCs 上。TGF-β1、Sox2、β-catenin 和 Notch 等信号通路在 OSCs 启动和调节中的作用已经引起广泛关注，并且这些发现很有前景。最近关于表观遗传干预的研究也令人鼓舞，尤其是印迹基因TSSC3 等。OSCs 生态位和微环境的影响也可以提供另一种方法来阐明有助于 OSCs 生成和调控的事件。

尽管取得了一些进展，但是许多关于 OCS 的研究都集中在个体功能或机制上，并且研究没有相互关联。进一步的发展将需要系统和深入地了解 OSCs 表型的调节和维持的分子机制及其在 OS 中的影响，以便改善患者的预后。