干细胞冷冻保护剂的研究进展

张天钰 综述 周双白 李青峰 审校

【提要】 干细胞具有促进组织修复与再生的作用，蕴藏着广泛的临床应用前景。低温冻存是实现干细胞长期保存的常用方法。在低温保存过程中，有效的冷冻保护剂（CPA）对于防止细胞低温损伤和保持细胞活力至关重要。本文将对干细胞冷冻保护剂的研究进展进行综述。

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，如胚胎干细胞、诱导多能干细胞以及间充质干细胞等，其在特定的条件下能分化成体内多种类型的细胞[1-3]。干细胞具有多种用途和功能，可用于体外研究组织器官的生长发育、建立疾病模型、药物筛选，也可用于疾病治疗，如组织修复与再生等[4-5]。干细胞的长期保存需要进行冷冻保存，但冷冻保存的过程对细胞具有一定的损伤。冷冻保护剂可保护细胞免受低温冻存中的冷冻损伤，能更好地保存细胞的生物性能。本文将对近年来干细胞冷冻保护剂的研究进展进行综述。

1 冷冻损伤的机制

组织和细胞虽可在-196 ℃低温下长期保存，但易在降温和复温过程中受溶液冻结、融化以及溶液渗透压变化等因素的作用而受到损害。冷冻损伤通常发生在0 ℃到-60 ℃的温度范围内。对于引起冷冻损伤的机制一直是低温生物医学的研究热点，目前存在多种假说，比如电解质失衡假说、两要素假说、生物膜损伤假说以及结构假说等[6]。其中，Mazur 等[7]提出了“两要素假说”，认为引起细胞冷冻损伤的因素主要有以下两种。

1.1 细胞内冰晶的形成（Intracellular Ice Formation，IIF）

高速率冷却状态下的细胞内水分子被快速冻结后，细胞不再进一步脱水，使其内部的水分子不能玻璃化，进而提高了细胞内冰晶的形成程度。冰晶会对细胞内的多种生物膜产生机械或者生物化学应力，导致细胞产生不可逆的损伤。研究表明，大的内部冰晶的存在是致命的[8]。细胞内冰晶是否对细胞造成严重损伤取决于冰晶的大小、位置、数量以及复温条件[9-10]。复温解冻时，缓慢升温将使细胞内冰晶玻璃化之后的水形成结晶或重结晶，这将会对细胞造成致死性损伤。

1.2 溶液效应损伤

冰晶会诱导细胞内和细胞外溶液性质的改变，细胞长时间暴露于改变的内外溶液中将会产生低温损伤，这些改变或溶液效应包括溶质的浓度、酸碱平衡、细胞膜内外渗透压的改变以及严重脱水后溶质浓缩沉淀[11]。

2 冷冻保护剂作用机制

冷冻保护剂可以同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程，使溶液的黏性增加从而减少冰晶的形成[12]，同时冷冻保护剂可通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。研究表明，细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜通常分为两大类型：渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂[13]。渗透性冷冻保护剂多为小分子中性物质，其作用为弱化水结晶过程以及减少对细胞结构和功能的破坏，主要包括甘油、二甲基亚砜（DMSO）、丙二醇、乙二醇、乙酰胺、甲醇等。非渗透性保护剂多为大分子物质，通过降低溶质浓度减少低温冻存对细胞的伤害，主要包括海藻糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖、白蛋白等。

3 经典的冷冻保护剂及其存在的问题

经典的冷冻保护剂为10%DMSO，可加入10%～90%FBS（提供营养），因成本低廉、效果优良、易操作，而被广泛应用于干细胞的冷冻保存[14]。然而，DMSO 作为经典的冷冻保护剂虽可降低保存液的冰点并减少胞内冰的形成，但是一系列的研究表明，DMSO 可能会改变染色体的稳定性，并导致细胞端粒长度的变化，反过来导致肿瘤的形成[15-16]；并且，DMSO 自身也具有一定的毒性[17]。DMSO 对组织和细胞的毒性取决于暴露时间、温度和浓度，另外FBS 为异种动物组分，有引入人朊病毒而造成人畜共患病及导致免疫反应等风险[18]；同时，血清的组分、来源和生产批次，对培养的细胞可能会有不良或不一致的影响。

4 新型冷冻保护剂

无毒性、易洗脱以及无异种抗原是新型冷冻剂选用的原则。根据这一原则，近几年来国内外最新研究报道了几类新型冷冻保护剂。

4.1 无异种蛋白的冷冻保护剂

无异种蛋白的冷冻保护剂分为两类。一类为人白蛋白冷冻保护剂，Park 等[19]使用人白蛋白替代了FBS，即生理盐水+10%DMSO+9%人体白蛋白（HSA）冻存hADSC，冻存1 周后复苏，与经典冷冻保护剂对比，细胞存活率和细胞表型均无显著性差异，集落形成能力（CFU）、成脂、成骨和成软骨实验结果均好于经典冷冻保护剂。该冷冻保护剂不含有动物源性血清，不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性。另一类为人血小板裂解物（PL）冷冻保护剂。Wang 等[20]通过使用97%人类血小板裂解物+3%DMSO、95%FBS+5%DMSO 以及90%FBS+10%DMSO 三组冻存液分别冻存hADSC，复苏后发现三组细胞的存活率均高于80%；在无DMSO 冷冻保护剂存在的条件下，经过自身PL 处理过的hADSC 比FBS 处理过的hADSC 拥有更高的存活率、更好的成骨分化能力以及更短的倍增时间。这种冷冻保护剂无任何动物成分和异源性成分，可减少DMSO 的浓度，同时可释放多种生长因子促进hADSC 体外增殖，但对于PL 促进细胞生长的机制及其在其他干细胞中的冻存效果还需进一步了解[21]。

4.2 海藻糖

海藻糖无毒，易洗脱，在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下，能在细胞表面形成独特的保护膜，具有较高的玻璃转变温度[22-23]，可防止细胞内冰晶的形成。娄琳等[24]分别使用不同浓度的海藻糖冻存造血干细胞，冻存后通过锥虫蓝拒染法检测细胞存活率和CD34-PE/CD45-FITC 双标法流式细胞仪检测CD34+细胞回收率（冻存后值/冻存前值×100%）。实验证明，海藻糖对于短期内低温冻存的造血干细胞有一定的保护作用，其中0.5 M 的海藻糖冻存效果最好。Martinetti 等[9]分别使用不同浓度的海藻糖和经典冷冻保护剂冻存人外周血干细胞，复苏后检测细胞活性和增殖能力。结果显示，1.0 M 海藻糖冻存效果好于经典的冷冻保护剂。在此基础上，Ntai 等[25]分别使用不同浓度的渗透性冷冻剂和非渗透性冷冻保护剂相结合来冻存人的多能干细胞，冻存1 周后复苏，通过测定细胞活性、染色体的稳定性以及基因毒性等检测，证实0.5 M 海藻糖结合10%甘油冻存多能干细胞的效果好于单独使用海藻糖。

4.3 含0.5%琼脂糖液体弹珠（Liquid Marbles，LM）

LM 是被高疏水性颗粒包裹形成的不润湿的液滴，可稳定地黏附于固体及液体表面，是一种冻存细胞的新型材料[26]。有研究使用含有0.5%琼脂糖和50% FBS 的LM 冻存鼠的3T3 细胞和L929 成纤维细胞，复苏后发现，不管是在细胞形态、细胞存活率还是细胞增殖方面，均好于传统冻存剂，与新鲜细胞无明显差异[27－28]。但是，LM 中含有FBS 成分，对于如何去除FBS 还有待于进一步研究。

4.4 羟乙基淀粉（Hydroxyethyl Starch，HES）

HES 是一种非渗透性保护剂，不仅可以在冷冻过程中减少细胞内冰晶的形成，还可降低DMSO 的浓度，减少对细胞的损伤。鲁瑞周等[29]使用5%DMSO+HES 冷冻保护剂冻存脐带造血干细胞，与10%DMSO 冷冻保护剂冻存过的细胞比较，发现两者虽然在细胞存活率方面无显著差异，但前者的粒-巨噬细胞集落回收率（CFU-GM）明显更高，且存在显著性差异。李雯瑛等[30]使用DMSO+HES 联合冷冻保护剂冻存外周造血干细胞，冻存2 周后复苏，发现细胞的存活率以及CFUGM 均达90%。

4.5 海藻酸钠联合丙二醇（PROH）

海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，其水溶液可在温和的条件下快速形成凝胶，当有Ca2+等阳离子存在时，可发生离子交换，形成交联网络结构，从而形成水凝剂，包裹细胞，在冻存时可以抑制细胞内冰晶的形成[31]。丙二醇其化学性质稳定，毒性小且具有较低的冰点，常用作冷冻保护剂。Huang 等[32]首先使用海藻酸钠包裹细胞，然后加入丙二醇等作为冷冻保护剂冻存mESC 和hADSC，冻存后发现不管在细胞活性、增殖能力还是功能学上，均与新鲜细胞无显著性差异，且可以很好地促进细胞的玻璃化冻存以及避免细胞复苏过程中反玻璃化现象的出现。

5 总结与展望

干细胞具有良好的临床应用前景，其长期安全稳定保存是一重要问题。冷冻保护剂可有效降低细胞损伤，提高细胞冻存后的活性。经典冷冻保护剂含有DMSO，并不适合临床使用，安全无毒、无异种抗原的冷冻保护剂是目前研究的主要方向，新型冷冻保护剂的开发对干细胞临床应用具有重要意义。