结缔组织病相关肺间质病的生物标志物

郭林红，周 炜

肺间质病(interstitial lung disease, ILD)是一组以肺泡单位炎症和间质纤维化为基本病变的弥漫性肺疾病。其临床表现为活动后气促与干咳，疾病进展出现进行性加重的呼吸困难；肺功能检查出现弥散功能减低，晚期出现限制性通气功能障碍；影像学检查见双肺弥漫性病变。引起ILD的病因多样，包括环境因素、职业、药物、免疫反应等。其中结缔组织病(connective tissue disease，CTD)是通过自身免疫反应引起ILD的主要病因之一[1]。ILD也是CTD的常见并发症，各种结缔组织病相关肺间质病(connective tissue disease-associated interstitial lung disease, CTD-ILD)的发生比例分别为：SSc 60%～100%、PM/DM 20%～50%、RA 10%～50%、SLE 3%～13%、pSS 10%～30%、MCTD 30%～85%。

参照2002年美国胸科协会和欧洲呼吸学会对特发性间质性肺炎的分型标准， CTD-ILD的病理分型分为：普通型间质性肺炎(usual interstitial pneumonia, UIP)、非特异性间质性肺炎(nonspecific interstitial pneumonia, NSIP)、机化性肺炎(organizing pneumonia, OP)、弥漫性肺泡损伤(diffuse alveolar damage, DAD)、淋巴细胞性间质性肺炎(1ymphocytic interstitial pneumonia, LIP)[2]，目前CTD-ILD研究常借用这个病例分型。

目前CTD-ILD的诊断主要依靠临床表现、肺高分辨率CT(HRCT)及组织病理学检查等；治疗上主要应用糖皮质激素(glucocorticoid, GC)联合免疫抑制剂。继发于不同CTD，以及不同病理类型的ILD的自然病程、治疗反应以及预后均不尽相同。寻找与CTD-ILD发生、发展相关的生物标志物，可能在疾病的早期诊断、判断预后、预测治疗反应、监控疾病进展及探索治疗靶点等方面发挥作用，具有重要临床意义。目前CTD-ILD的发病机制研究主要涉及肺泡上皮细胞功能障碍、免疫调节异常、成纤维细胞活化/基质重塑[3-4]。本文对参与上述CTD-ILD主要发病机制相关的生物标志物进行综述。

1 肺泡上皮细胞功能障碍

1.1 肺泡表面蛋白

肺泡表面蛋白(surfactant proteins, SPs)是由肺泡Ⅱ型细胞合成并分泌的一种脂蛋白复合物，目前共发现四种蛋白，即表面蛋白A(SP-A)、表面蛋白B(SP-B)、表面蛋白C(SP-C)及表面蛋白D(SP-D)。它们的作用包括促进肺表面活性物质功能，降低肺泡表面张力、提高肺的顺应性、参与主动防御过程等。Takahashi等[5]通过ELISA法检测42例SSc(包括30例SSc-ILD)患者和108例健康对照血清SP-A和SP-D的水平，结果SSc-ILD患者血清SP-A和SP-D明显高于单纯SSc患者及健康对照；SP-A和SP-D增高诊断SSc-ILD的敏感性分别为33%、77%，特异性分别为100%、83%；提示SP-A和SP-D可以作为诊断SSc-ILD的生物标志物，且SP-D敏感性较SP-A高。 Yamakawa等[6]发现SSc/MCTD-ILD患者血清中高水平的SP-D与用力肺活量(forced vital capacity, FVC)的呈负相关，并可以作为预测FVC短期下降的生物标志物。

1.2 涎液化糖链抗原

涎液化糖链抗原(Krebs von den Lungen-6, KL-6)是一种高分子量的黏蛋白样糖蛋白，由肺泡Ⅱ型细胞和支气管细胞表达，属于黏液素MUC1家族。多种肺部疾病均会出现血清和肺泡灌洗液中KL-6水平升高，可能反应肺泡Ⅱ型细胞损伤。Chen等[7]在一项前瞻性研究中通过ELISA法检测100例PM/DM患者(包括56例PM/DM-ILD)基线以及56例PM/DM-ILD患者治疗2个月后血清KL-6、SP-A、SP-D和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的表达水平，研究发现PM/DM-ILD患者基线血清KL-6、SP-A、SP-D和MCP-1的表达水平明显高于PM/DM患者，且PM/DM-ILD患者治疗前后KL-6的表达水平与ILD的严重程度呈正相关；KL-6不但可以作为预测PM/DM-ILD的生物标志物，也可以用来监测ILD的治疗反应。在另一项前瞻性研究中证实了基线升高的血清KL-6可能可以预测轻度肺损伤的SSc-ILD患者的肺功能恶化[8]。肺间质病变超声检查出现特征性的“B线”改变， Wang等[9]发现，肺部超声B线与KL-6血清水平具有较好的一致性，两者结合可以更好的监测ILD的进展。

2 免疫调节异常相关的细胞因子和趋化因子

2.1 巨噬细胞活化

CD163是一种特异性表达于活化的巨噬细胞和单核细胞表面的清道夫受体，在急性、慢性炎症反应时，CD163从活化的巨噬细胞表面以酶切的方式脱落，血中可溶性CD163(sCD163)是单核巨噬细胞的标志。Enomoto等[10]在一项回顾性研究中，通过ELISA法测定48例PM/DM-ILD、10例PM/DM、20例健康者血清sCD163的表达水平，结果PM/DM-ILD患者血清sCD163水平明显高于PM/DM组及健康组；并通过免疫组化及Cox回归模型证明高水平的sCD163 PM/DM-ILD患者肺部病变严重、预后差；表明sCD163水平可能可以作为预测PM/DM-ILD患者肺部病变严重及不良预后的生物标志物。

2.2 趋化因子

CCL18又称肺活化调节趋化因子(pulmonary and activation-regulated chemokine, PARC)，主要由Th2型细胞因子如IL-4、IL-10和IL-13等激活，肺泡巨噬细胞产生，在肺中高水平表达。Kodera等[11]通过一项回顾性研究，比较SSc-ILD患者中血清CCL18与KL-6、SPD水平，结果表明SSc-ILD患者血清CCL18水平升高，与DLCO和VC呈负相关，且敏感性较KL-6、SP-D强。Hoffmann-Vold等[12]通过一项前瞻性研究发现，SSc-ILD患者的血清中，CCL18血清水平越高每年FVC下降程度越快，肺纤维化进展越重，可以作为预测SSc-ILD疾病进展的生物标志物。

CXCL10又称为干扰素γ诱导蛋白10(Interferon gamma-induced protein 10, IP-10)，通过干扰素γ诱导巨噬细胞、内皮细胞或成纤维细胞表达产生；通过结合趋化因子受体CXCR3趋化T细胞和单核细胞来调节免疫反应；在Th1型慢性炎性疾病中起主要作用。Chen等[13]通过ELISA方法检测中国RA队列、独立的美国RA队列不同程度的肺间质病患者血清CXCL10表达水平，研究结果示RA-ILD患者，无论病情轻重，血清CXCL10水平均显著升高，可作为诊断RA-ILD的生物标志物。

2.3 细胞因子

IL-18是一种Th1型细胞因子，主要是由活化的单核-巨噬细胞产生，在Th1免疫反应活化中发挥重要作用。Yang等[14]通过ELISA方法检测49例DM/PM(包括33例DM，16例PM，其中含18例DM-ILD，6例PM-ILD)及20例健康者血清IL-18的表达水平，结果DM-ILD患者血清IL-18表达水平明显高于DM组及健康对照组，表明IL-18可以作为诊断DM-ILD的生物标志物。

IFN-γ也是一种Th1型细胞因子，主要由活化的CD4+Th1分泌，CD8+T细胞、自然杀伤细胞以及单核细胞来源的树突状细胞等抗原提呈细胞也可表达。Ishikawa等[15]通过ELISA检测9例DM 并发快速进行性ILD(rapidly progressive ILD,RP-ILD)的患者及10例DM和19例健康者多种细胞因子(IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-α,IFN-γ, TNF-α)的血清表达水平，结果DM RP-ILD患者血清IFNγ表达水平明显高于DM及健康对照；免疫组化显示DM RP-ILD患者肺组织以及肺门淋巴结有大量IFN-γ+细胞浸润；表明IFN-γ参与了DM RP-ILD 的肺部病变。

3 成纤维细胞活化/基质重塑

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一组锌离子依赖性的蛋白水解酶家族，在生理状态下参与胚胎形成、新生血管的形成及伤口的愈合；在病理状态下参与关节炎、癌症、心血管疾病、肺纤维化等；其在降解细胞外基质作用上发挥主要作用。MMP1是一种间质胶原酶，由肺泡Ⅱ型细胞表达，主要降解Ⅰ型和Ⅲ型纤维胶原分子，正常情况下很少表达[16]。Oka等[17]发现MMP1血清水平在RA并发急性弥漫性ILD患者中明显增高。MMP7又称溶素(matrilysin)，主要有黏膜上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞和巨噬细胞分泌[18]。在动物模型中敲除MMP7后，博莱霉素引起的肺纤维化可以减轻[16]。Chen等[13]发现在RA-ILD患者中血清MMP-7表达水平增高，与病变程度无关，可作为诊断RA-ILD的生物标志物。MMP9又称明胶酶B(gelatinase)，在动物实验中发现其在肺组织重塑中发挥作用[19]。Andersen等[20]发现SSc-ILD患者肺泡灌洗液中MMP9水平较单纯SSc及健康对照组明显增高。MMP12又称巨噬细胞弹性蛋白酶(macrophage elastase)，可降解多种细胞外基质。Matutebello等[21]通过动物实验发现MMP12敲除的小鼠可免受Fas诱导的纤维化，提示MMP12可能是纤维化反应的主导介质。Manetti等[22]通过ELISA检测，SSc-ILD患者血清MMP12水平明显高于单纯SSc患者，并与肺纤维化严重程度相关。

4 自身抗体

一些自身抗体可见于CTD-ILD，但是并不具有特异性，如抗SSA/Ro52、抗Scl-70，以及抗CCP。这些自身抗体在ILD患者中阳性率增高的原因还不清楚，是否可以成为生物标志物还有待进一步研究。因免疫耐受被打破，产生自身抗体，出现异常免疫反应造成组织器官损伤是许多CTD的发病机制。近来陆续报道了多种CTD-ILD相关的自身抗体，可帮助CTD-ILD的诊断、预后判断和治疗决策。

4.1 黑色素瘤分化相关蛋白5

黑色素瘤分化相关蛋白5(melanoma differentiation．associated gene 5, MDA5)又称干扰素诱导的解螺旋酶C结构域蛋白1(IFN induced with helicase C domain protein l, IFIHl)，是视黄酸诱导基因Ⅰ相关受体(retinoic acid inducible gene Ⅰ like receptor, RIG-Ⅰ like receptor，RLRs)家族中的重要成员，能识别胞质内双链RNA(dsRNA)并诱导炎性因子和细胞表面分子的产生。Sato等[23]通过ELISA研究发现抗MDA5抗体是DM-RPILD的独立危险因素，且抗体滴度与疾病活动及严重程度相关，治疗前抗体滴度水平高提示疾病活动、病变重，治疗后抗体滴度水平下降提示疾病缓解。Li等[24]通过荟萃分析同样证实了抗MDA5抗体与DM-ILD和DM-RPILD相关，并可以作为诊断DM-RPILD的生物标志物。Chen 等[25]通过免疫印迹法证实PM/DM-ILD患者中，抗MDA5抗体阳性的患者肺部病变重，治疗反应差，预后差。但是也有文献报道，在抗MDA5抗体阳性的ILD中，抗MDA5抗体治疗前后的滴度改变并不能评估治疗反应，而血清铁蛋白治疗前后表达水平的变化可以评估治疗反应，可能的机制是巨噬细胞激活参与了抗MDA5抗体相关ILD的发生，铁蛋白增高反映了巨噬细胞激活程度[26-27]。

4.2 抗氨酰基-tRNA合成酶

抗氨酰基-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase, ARS)属于催化氨基酸与其相应的转运RNA结合的胞质酶家族，是PM/DM特异的自身抗体，主要包括抗Jo-1(组氨酰)、抗PL-7(苏氨酰基)、抗PL-12(丙氨酰)、抗EJ(甘氨酰)、抗OJ(异亮氨酰)、抗ZO(苯丙氨酰)、抗KS(天冬氨酰基)和抗Ha(酪氨酰基)8种，其中抗Jo-1最常见，20%～30% PM、2～10% DM可以检测到，抗PL-7、抗PL-12仅在3%～4%的PM/DM患者中检测到，而其他抗体检出率小于2%[28]。此类抗体阳性的患者具有一组特殊的临床症候群，被称为抗体综合征，如肌炎、肺间质病变、对称性多关节炎、雷诺现象、技工手、急性发热等，其中肺间质病变是其主要症状，其中抗Jo-1对肌炎相关的ILD预测能力最强[28-29]。Chen 等[25]研究发现抗ARS阳性的PM/DM-ILD患者也可出现RPILD，但发生率较抗MDA5阳性患者低，而对免疫抑制剂治疗反应好的比例高、预后好。

4.3 钾离子通道调节蛋白

钾离子通道调节蛋白(potassium channel regulator,KCNRG)是钾离子四聚化结构域蛋白(potassium channel tetramerization domain-containing protein，KCTD)成员之一，可以通过四聚化T1结构域形成多聚体，对电压门控钾离子通道hKv1.1和hKv1.4产生作用，减少钾离子内流[30]。有文献报道KCNRG蛋白主要分布在小气道上皮细胞，并在Ⅰ型自身免疫性多内分泌腺病综合征(Autoim-mune Polyglandular Syndrome Type 1, APS-1)并发肺部疾病患者的血清中检测到了针对该蛋白的自身抗体，提示KCNRG可能是自身免疫性肺损伤的肺组织特异性抗原[31]。但是在另一篇文献中，APS-1并发肺部疾病的患者中并未检测到抗KCNRG抗体[32]。因此，KCNRG是否为自身免疫性肺病相关的自身抗原需要更多研究。

4.4 杀菌/渗透增强蛋白B1

杀菌/渗透增强蛋白B1(bactericidal/permeability-increasing fold containing B1, BPIFB1)是长片段PLUNC(palate, lung and nasal epithelium clone)的成员之一，含有484个氨基酸，又称为LPLUNC1,主要在肺部表达，可能对呼吸道起天然防护作用[33]。Bingle等[34]发现BPIFB1在囊性纤维化肺病患者小气道上皮的杯状细胞内表达增多。Shum等[32,35]在Ⅰ型自身免疫性多内分泌腺病综合征(Autoimmune Polyglandular Syndrome Type 1, APS-1) 患者及与其相关的自身免疫病小鼠模型中发现BPIFB1与ILD相关，并在特发性ILD和CTD-ILD患者血清中检测到了抗BPIFB1抗体,提示抗BPIFB1抗体是肺部自身免疫疾病的特异标志物。

总体上说，生物标志物客观计量，简单易行，具有一定的敏感性和特异性，不仅可以作为CTD-ILD的早期诊断指标，也可以监测CTD-ILD的病情变化、判断患者预后。近年来，对CTD-ILD发病机制的研究取得了进展，许多潜在的生物学标志物被认识到。但是目前多为小样本和单中心的研究，且集中于硬皮病、类风湿关节炎、肌炎相关的肺间质病变，对其他CTD-ILD研究不足。因此需要多中心大样本队列研究验证报道的生物学标记物的临床意义，才能更有效的指导临床实践。