覆盆子对尼古丁戒断焦虑征大鼠的影响*

邢宇双 梁启超 金贲临 梁忆红 雷 涛 杨 志 吴宜艳

（1.牡丹江医学院药学院，牡丹江 157011）（2.牡丹江医学院第二附属医院，牡丹江 157011）（3.齐齐哈尔医学院研究生处，齐齐哈尔161006）

尼古丁、阿片类药物的滥用、依赖和成瘾是亚洲、北美洲、东南欧等许多国家和地区日益严重的社会问题。当前，对尼古丁、吗啡等药物成瘾后的戒断治疗是学者们研究的热点问题[1-2]。美国精神病协会认为尼古丁依赖主要是由于个体反复摄取尼古丁所导致的一种慢性易复发的综合症，这是一类神经活性物质滥用所致的疾病[3]。尼古丁依赖满足美国精神疾病诊断标准DSM-Ⅳ中对物质依赖的诊断标准，这一诊断标准包括冲动性使用，停药困难，慢性使用后停药会产生戒断症状。尼古丁依赖包括躯体依赖和精神依赖。躯体依赖又称生理依赖，即反复摄入尼古丁，当停止用药则会发生一系列症状与体征，且令人难以忍受。这些症状与体征包括烦躁不安、易怒、焦虑、情绪低落、注意力不集中、失眠、心率降低、食欲增加、抑郁等。精神依赖又称心理依赖，俗称心瘾，尼古丁的精神依赖表现为对尼古丁的强烈渴求[4]。

覆盆子为蔷薇科悬钩子属植物，具有补肾固精、助阳等功效。大量研究表明覆盆子果实中富含鞣花酸、多糖、花青素、超氧化物、多酚类、黄酮、超氧化物歧酶等[5-6]，具有抗衰老、治疗泌尿道感染、减肥、抗癌防癌、保护心脏、抗氧化、降血脂、降血糖、防止心血管疾病等药理作用[7-13]，但针对覆盆子的抗焦虑作用却鲜有报道。本实验研究覆盆子提取物对尼古丁戒断大鼠焦虑征的作用，并探讨其作用机制，为覆盆子的功能开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD雄性大鼠，体质量220～250 g：由哈尔滨医科大学动物室提供。

1.2 实验药品及试剂

覆盆子：购于牡丹江天利医药（经生药学鉴定为蔷薇科悬钩子属植物华东覆盆子的果实）；尼古丁：购于上海时代生物科技有限公司；氯化钠注射液（0.9%）：哈尔滨三联药业有限公司批号 140409F3；磷酸二氢钾：天津博迪化工股份有限公司批号140606分析纯；去甲肾上腺素盐酸盐：上海基实药业有限公司批号 20140513；甲醇：天津市永大化学试剂有限公司批号 20150104色谱纯；高氯酸：哈尔滨试剂化工厂批号 20141201分析纯；地西泮：天津金耀药业有限公司。

1.3 实验仪器

高效液相色谱仪LC2103：上海天美科学仪器有限公司 Kromasil 100-5C18 250x4.6 mm；离心机：eppendorf centrifuge 5424； 匀 浆 机： motor cordless749540-0000；高架十字迷宫：上海欣软信息科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 覆盆子提取物的制备：取干燥的中药覆盆子500 g磨成细粉，于乙醇中回流提取，过滤，减压蒸发，冻干。提取物根据冻干粉的干重估计，产率为10.6%。

1.4.2 建立尼古丁成瘾模型剂量设计：选取健康SD雄性大鼠40只，体质量（220～250）g，随机分为空白对照组（生理盐水），模型对照组（0.4 mg/kg尼古丁），药物对照组（0.4 mg/kg尼古丁 +地西泮），覆盆子高剂量组（0.4 mg/kg尼古丁+覆盆子提取物200 mg/kg），覆盆子低剂量组（0.4mg/kg尼古丁+覆盆子提取物100 mg/kg）。除空白组外，其余4组每天皮下注射尼古丁0.4 mg/kg/d，共7 d，制备尼古丁成瘾模型。最后一次注射尼古丁后24 h，药物对照组给予地西泮（根据临床剂量0.1 mg/kg体质量），覆盆子高、低剂量组分别灌胃覆盆子提取物200 mg/kg、100 mg/kg，连续 5 d，最后一次给药 1 h后，用高架十字迷宫测其焦虑行为。

1.4.3 行为学指标测试：高空十字架是由2个开放臂和2个闭合臂以及1个中心部分（10 cm×10 cm）组成。若大鼠在开放臂的时间探索增加，那么其焦虑程度较低，若大鼠在开放臂的探索时间减少，那么其焦虑程度较高。实验室内光线昏暗并保持恒亮，室温24℃，并保持安静。将每只大鼠置于高空十字架（EPM）的正中央（头面向开放臂）释放，大鼠在迷宫中的行为被视频跟踪系统自动记录，每只大鼠测试时间为5 m in，实验人员在距离测试箱2 m处观察并记录下大鼠的活动状况。每一只动物完成测试后，清理粪便，并对装置用酒精进行彻底清洁消毒。

测试指标：进入到开放臂次数（OE open arm entry）：即进入到任一开放臂的次数，以大鼠 4个爪均进入到臂内开始，中途有1个爪从该臂中完全撤出，那么该次进入活动完成；进入到开放臂的时间（OT open arm time）：进入到开放臂停留的时间，单位：秒（s）；进入到闭合臂次数（CE close arm entry）：即进入到任一闭合臂的次数，以大鼠4个爪均进人到臂内开始；进入到闭合臂时间（CT close arm time），进入到闭合臂停留的时间，单位：秒（s）。 由以上指标分别计算出：①进入到开放臂和闭合臂的总次数（OE+CE）：表示大鼠的自发活动（locomotor activity）；② 进开放臂次数比例（OE%）=OE/（OE+CE）×100%；③开放臂停留时间比例（OT%）=OT/（OT+CT） ×100%

1.4.4 海马中去甲肾上腺素（NE）的含量测定：所有大鼠都完成高架十字迷宫（EPM）测试后，立即将每只大鼠断头处死，将大脑放在冰盘上，剪开颅盖和脑膜，剥离组织后，迅速取出左右两侧海马，称其质量后，立刻放入-80℃的液氮中保存，之后转移到-80℃低温冰箱里存放。

绘制线性回归方程：取去甲肾上腺素（NE）标准品约2.5 mg，精密称定，用0.1 mol/L HClO4溶解并定容到50 m L作为对照品贮备液。精密吸取贮备液10、20、40、80、160 μL，分别稀释成 1.25、2.5、5、10、20ng/μL，以浓度（c）为横坐标（X），峰面积（A）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，并进行线性回归，得出回归方程。

海马中去甲肾上腺素（NE）的含量测定：在海马样品中加入-4℃保存的0.1 mol/L高氯酸处理液0.1 g/m L，置于冰水混合物中用匀浆机匀浆1 min。将上述物质放入离心机中，以15 000 r/m in离心20 min，吸取上清液。将上清液再次以15 000 r/min离心20 m in，上清液以0.22μm的微孔滤膜过滤。以50μL微型注射器吸取20μL进样，高效液相色谱系统检测。

色谱条件色谱柱为4.6×250 mm，Kromasi 100-5Cl8，流动相为甲醇∶磷酸二氢钾（0.15 mol/L pH=5.5） =1∶9等度洗脱，流速为 l m L/min，室温，波长280 nm，样品中各主要组分用外标法进行定量。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 覆盆子提取物对大鼠OE%和OT%的影响

结果显示（表1）：在高架十字迷宫中，与空白对照组相比，尼古丁戒断大鼠在开放臂的逗留次数、时间明显减少（P＜0.05）；与模型对照组相比，药物对照组能增加其次数、时间（P＜0.05），覆盆子高剂量提取物作用效果更显著（P＜0.01）。

表1 覆盆子对尼古丁戒断大鼠进入开放臂次数比（OE%）、开放臂停留时间比（OT%）的影响（±s ±s）Table 1 Effects of raspberry on the ratio of open arm s to OE%and open arm stay tim e（OT%）in nicotine w ithd raw al rats（ ±s ±s）

表1 覆盆子对尼古丁戒断大鼠进入开放臂次数比（OE%）、开放臂停留时间比（OT%）的影响（±s ±s）Table 1 Effects of raspberry on the ratio of open arm s to OE%and open arm stay tim e（OT%）in nicotine w ithd raw al rats（ ±s ±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01Note： Compared with the blank control group， *P＜0.05， **P＜0.01； compared with the model control group， #P＜0.05，##P＜0.01

空白对照组8 45.97±5.55 49.69±3.19模型对照组 8 29.78±10.60* 32.85±4.69**覆盆子高剂量组 8 43.75±6.71## 45.70±9.00##覆盆子低剂量组 8 34.48±7.26 35.49±6.37药物对照组 8 38.25±10.13# 39.69±8.99#

2.2 海马中NE的含量

结果显示（图1）：与空白对照组相比，尼古丁成瘾大鼠海马中去甲肾上腺素的含量显著升高（P＜0.01），与模型对照组相比，覆盆子高剂量组、覆盆子低剂量组可降低海马中去甲肾上腺素含量（P＜0.05），药物对照组效果更显著（P＜0.01）。

3 讨论

许多研究表明，在EPM测试中上瘾的物质包括尼古丁和乙醇，在戒断期间可产生严重的焦虑样行为。自发活动的增加就是一个重要的行为学指标，暗示啮齿类动物的焦虑样行为[14]。本实验结果表明，尼古丁戒断大鼠可表现出焦虑，其在开放臂停留的时间与空白组相比较短，进入开放臂次数也相对减少。目前，药物治疗是抗焦虑的最直接治疗方法[15]，代表药物地西泮临床应用较为广泛，本实验也观察到地西泮可明显减轻焦虑行为，然而，众所周知的苯二氮类药物具有很大的局限，近来中草药在治疗情绪障碍如抑郁症和焦虑变得更受欢迎了。据报道，在迷宫实验中酸枣仁可大大改善小鼠的焦虑行为[16]。在目前的研究中，200 mg/kg的覆盆子提取物可明显改善尼古丁戒断期间大鼠的焦虑行为，而低剂量覆盆子提取物作用效果不太明显，说明覆盆子提取物对焦虑样行为的作用效果与给药剂量存在一定关系。

图1 覆盆子对尼古丁戒断大鼠海马NE含量的影响Fig.1 Effect of Raspberry on NE Content in H ippocam pus of Rats w ith Nicotine Withdrawal

尼古丁可增强胆碱能系统的活性，破坏脑细胞增殖与分化之间的协调性，使细胞由分裂增殖转向分化。尼古丁可增强血清素类递质系统如多巴胺（dopamine，DA）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、5-羟色胺（5hydroxy tryptamine，5-HT）等的合成、释放和代谢活性[17-18]，这可能与兴奋性神经精神症状的产生有关。许多中枢神经递质都参与尼古丁成瘾的形成过程，主要包括 DA、阿片肽（opioid peptides，OP）、谷氨酸（glutamate，Glu）、乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）、5-HT、NE。尼古丁可直接刺激 NE能神经末梢，还可通过诱导 γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）的释放进一步刺激NE的分泌。

本实验条件下观察到高、低剂量的覆盆子均有降低大鼠海马内NE的趋势，提示降低海马中NE的释放，可能是覆盆子抗尼古丁戒断焦虑作用的重要环节之一。本研究结果显示：与空白对照组比较，模型组大鼠海马中NE含量明显升高，表明焦虑产生时脑内NE释放增加；与模型组相比较，经治疗后对照组、覆盆子组大鼠海马中NE含量均降低，表明覆盆子对大鼠海马组织的单胺类神经递质有降低作用，其抗焦虑症的作用机制可能与降低脑内海马组织中NE的释放有关。

综上所述，本实验探究覆盆子对尼古丁戒断期间焦虑样行为和海马中NE水平的作用。覆盆子治疗可缓解焦虑样行为，改善由尼古丁戒断引起的海马中NE含量的增加。这些结果表明，覆盆子通过海马中的去甲肾上腺素能使神经系统恢复正常来治疗啮齿类动物尼古丁戒断期间的焦虑样行为，进一步为覆盆子治疗尼古丁戒断提供了重要的依据。