探讨-20℃冻存条件下分装冻融对SD大鼠血清生化检测结果的影响

孙昌华 刘 娜 王春芳 张 娟 祝清芬

（山东省食品药品检验研究院，济南 250101）

在毒理学研究中，临床病理学是非常重要的一个分支学科。它是一门将临床医学和实验技术相结合，在实验室内通过对各种项目的检验，为药物毒性的评价提供重要依据的学科[1]。临床检验的目的是为临床提供准确可靠的实验诊断依据。为了保证实验数据的可靠性，在检验医学中必须坚持全面质量控制（total quality control TQC，即指对影响临床检验结果可靠性的各方面因素及各个环节进行质量控制）和全过程质量控制（即指对实验工作的全过程进行质量控制和质量管理）。全过程质量控制包括实验前（分析前）、实验中（分析中）和实验后（分析后）三个阶段的质量控制。在实验误差中实验前误差占70%，因而实验前质量保证对减少实验误差显得尤其重要[2]。

待检测的血液标本的保存是临床医学检验分析过程中，对其质量进行有效控制的一个重要组成部分[3]，血液标本的具体放置时间及方式，对检测得到的生化指标具体值所产生的影响及其原因是目前临床医学界所关注和探讨的一个焦点性课题[4-6]。资料显示，由于检验前对标本处理不当造成的检验误差占总的检验误差的60%以上[7-9]。文献报道，血液标本的保存方式对生化项目的检测结果具有重要影响[10-11]。在检验临床和科研工作中，经常要对血清标本进行冻存，以备日后检测或复查。“血清分装冻融检测会影响结果”似乎已成为共识。问题是影响程度有多大？导致结果升高还是降低？本文通过血清标本分装冻融对相关生化检测结果的影响，初步探索了血清检测过程中的各项指标的变化特点，为检验者提供最佳的检测时间提供参考，用科学的数据来说明标本前处理对检验结果准确性影响的重要性。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

7180全自动生化分析仪（日本日立）；台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；海信BCD-227uk电冰箱（海信集团）

1.2 试剂及耗材

血清生化促凝管（山东奥塞特医疗器械有限公司）；一次性使用血样采集针（山东奥塞特医疗器械有限公司）；4.5%戊巴比托纳（Sigma公司）；生化复合校准品（CFAS），生化质控物 Level 1（AMCC），生化质控物 Level 2（AMCC），ALT、AST、TP、ALB、GLU、UREA、CREA、TC、TG试剂盒（四川迈克生物科技股份有限公司）

1.3 实验动物

SD大鼠，SPF级，济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号 SCXK（鲁）20140007，雌性 SD大鼠40只，体质量280～330 g。

1.4 采集、离心

动物麻醉后，腹主动脉采集空白组SD大鼠血液，每只动物采集1管，每管约6～8 m L，编号标识，血液2～8℃静止30 min后离心，血清分装并用封口膜封口，每只动物分装4份。

1.5 方法

1.5.1 仪器校准及质量控制：仪器校准、质控按照本实验室的仪器标准操作规程进行。仪器开机后使用复合校准品分别对 ALT、AST、TP、ALB、GLU、UREA、CREA、TC、TG九项生化指标进行校准，待校准结束后进行复合质控品的检测。质控结果均在质控物靶值范围内方可进行检测。血清首次检测（室温4 h）应对仪器待检测项目进行校准，之后-20℃冻存各保存时间（2 d、7 d、14 d）如质控结果均在质控物靶值范围内时仪器则不进行校准。各保存时间（2 d、7 d、14 d）的每次检测均于检测前、检测后进行2次复合质控品的检测。

1.5.2 血清分组和冻融方式：血清标本离心，分装后用封口膜封口，每只动物分装4份。室温4 h完成第一份血清的检测，结果作为基准参考水平。其余三份血清放置于-20℃冻存，分别于保存时间的2 d、7 d、14 d各取一份进行检测。融化方式为直接将冷冻的血清标本取出后放置室温2 h左右以保证完全融化。

1.5.3 血清检测：室温4 h完成第一次检测，结果作为基准参考水平。 -20℃冻存的血清分别于保存时间的2 d、7 d、14 d各取一份进行检测，每次检测完毕后检测血清无需经害化处理。比较室温4 h与-20℃冻存各保存时间内生化检测结果的影响。

1.5.4 检测方法：检测操作按照生化分析仪操作规程及试剂盒说明书进行，保证所有标本在同一环境条件下、由同一人同时进行检测。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 冻存时间对血清外观的影响

血清在保存过程中颜色、浑浊度和其他物理性状，从肉眼观察未见明显变化，-20℃冻存条件下各保存时间内不同处理组之间未见明显区别。

2.2 冻存时间对血清检测结果的影响

见表1。

表1 不同保存条件下各项生化指标检测结果（±s±s，n=40）Table 1 Test results of various biochem ical indicators under differen t storage conditions（±s ±s，n=40）

表1 不同保存条件下各项生化指标检测结果（±s±s，n=40）Table 1 Test results of various biochem ical indicators under differen t storage conditions（±s ±s，n=40）

注：*P＜0.05与室温4 h比较Note：*P＜0.05 compared with Room temperature 4 h

ALT/（U/L） 22±3 20±4* 19±3*21±4 AST/（U/L） 158±34 155±40 139±35 157±37 TP/（g/L） 55.0±2.8 50.4±4.6*48.5±4.6* 51.8±5.4*ALB/（g/L） 33.7±1.5 30.8±2.3*29.5±2.6* 31.3±2.9*GLU/（mmol/L） 7.2±0.7 6.2±1.0*6.1±0.7* 6.3±1.1*UREA/（mmol/L） 6.1±1.1 5.7±0.9 5.5±0.9* 5.7±0.9 CREA/（μmol/L） 26±4 24±3* 21±3* 23±4*TC/（mmol/L） 1.47±0.34 1.35±0.36 1.28±0.34*1.36±0.34 TG/（mmol/L）0.45±0.10 0.42±0.10 0.41±0.12 0.44±0.12

3 讨论

药物毒理学安全性评价的目的是为了确保人用药物的安全。血液是药物作用最常见、最敏感、最大的靶器官，某些药物直接或间接作用于血液及造血系统，造成可逆或不可逆性的各种复杂的损伤[12]。2006年我们国家首部规范临床实验室管理的国家级法规《临床实验室管理办法》出台，标志我们国家临床实验室的管理已经进入了新的阶段，临床实验室对ISO15189的国际公认的实验室认可和认证的管理需要，都促使临床实验室检测结果的质量问题日益成为人们关注的热点问题。实验室的质量控制主要分为分析前、分析中、分析后，大量的实验表明[8-9]，临床实验室的质量问题超过60%以上来源于分析前，因此，分析前因素的控制就成为实验室检测结果准确性的重要保证，而标本的正确处理又是分析前因素中最为重要的因素之一[7]。

SD大鼠血清标本-20℃冻存条件下分装冻融检测结果分析可见，分装冻融14 d血清生化检测结果与室温4 h比较TP、ALB、GLU、CREA可见统计学差异（P＜0.05）；分装冻融7 d血清生化检测结果与室温 4 h 比较 ALT、TP、ALB、GLU、UREA、CREA、TC可见统计学差异（P＜0.05）；分装冻融2 d血清生化检测结果与室温4 h比较 ALT、TP、ALB、GLU、CREA可见统计学差异（P＜0.05）；分装冻融2 d、7 d、14 d血清生化检测结果与室温4 h比较 AST、TG均未见统计学差异（P＞0.05）。本研究结果表明，SD大鼠血清标本 -20℃分装冻融条件下2 d、7 d与室温 4 h比较，7项生化检测项目 ALT、TP、ALB、GLU、UREA、CREA、TC检测结果数据呈现降低趋势且检测结果具有统计学差异，分析其原因主要是由于在融冻过程中一些检测指标被破坏，即所谓的“冷变性”，造成了冻融后检测结果的偏低，与文献报道结果一致[13-14]。 -20℃分装冻融条件下14 d与 2 d、7 d比较，7项生化检测项目 ALT、AST、TP、ALB、GLU、TC、TG检测结果数据呈现升高趋势且部分检测结果具有统计学差异，综合分析其原因，尽管采取标本封盖、封口膜封口，防止血清标本蒸发等措施，因冻存时间的延长，最终还是影响检测结果，此结果与文献报道一致，随着保存时间的延长致使血清中水分蒸发加大，血清浓缩，其成分含量相对增加，检验结果升高[5-6，11，15-16]。 本次研究可见，-20℃分装冻融2 d、7 d、14 d血清生化检测结果与室温4 h比较AST、TG结果稳定均未见统计学差异，此结果与文献报道一致[6，17-19]。

研究显示，生化检测项目应尽早检测，尽量降低影响因素[6，11，15，20-21]。 所以，很多血液标本需要在采集后3～4 h内才能得到准确的结果[22]。研究表明，22～25℃血清或血浆的保存不超过8 h；8 h内不能完成时，血清或血浆应置于2～8℃保存；48 h内不能完成的实验项目，或分离的血清或血浆需储存48 h以上时，应于-20℃保存[2]；如需长时间保存后检测，最好选择-80℃冰箱进行保存，且以2个月保存期限检测结果较好[23]，选择 -80℃要比-20℃更加稳定[24-26]。相关文献资料报道，标本的保存时间与保存温度有关，22～24℃保存2 h，2～4℃保存4 h，-20℃保存2周，-80℃保存6个月[27]。本研究结果表明，-20℃分装冻融条件下SD大鼠血清标本对生化检测结果影响明显，分装冻融2 d、7 d因相关酶所谓的“冷变性”检测结果呈现降低趋势；分装冻融14 d随着保存时间的延长，致使血清中水分蒸发加大，血清浓缩，检验结果升高；AST、TG在 -20℃分装冻融 2 d、7 d、14 d内检测结果与室温4 h比较，数据稳定，未见明显影响。

综上所述，待测血清的保存方式及时间对生化项目检测结果具有重要影响，临床应给予高度重视，并根据各检测指示的差异，采取相应的保存措施，才能确保保存后的标本结果具有真实性和可靠性。