弓形虫快速鉴定及国内实验动物感染调查

高正琴

（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，T.gondii）在分类上属顶复亚门（Apicomplexa）孢子虫纲（Sporozoasida）真球虫目（Eucoccidiorida）弓形虫科（Toxoplasmatidae），是一种单细胞寄生虫。1908年，首先由法国学者Nicolle和Manceaux从一种叫做刚地梳趾鼠（Ctenodactylus gondii）的沙漠啮齿类动物的肝、脾单核细胞中分离出来，该动物被用作动物模型，在突尼斯巴斯德研究所查尔斯尼科尔的实验室里研究利什曼[1]。与此同时，Splendore在巴西的一只兔体内也发现了弓形虫[2]。随后，世界各地相继在多种脊椎动物体内发现了弓形虫。弓形虫有三个主要的生命周期阶段：1）速殖子（tachyzoite）（希腊语tachos=speed；快速繁殖的阶段）；2）缓殖子（bradyzoite）（希腊语 brady=slow；在组织中发现的可传播的阶段）；3）在猫的肠道中发现的有性阶段[3]。在实验室中，速殖子可以被无限期地维持和培养[4]。弓形虫的终宿主只有猫科动物，但其中间宿主十分广泛，包括人类、家畜、鸟类、海洋哺乳动物、蛇等[5]。人和动物感染率极高，引起弓形虫病（toxoplasmosis），呈世界性分布。据报道全球超过三分之一的人感染弓形虫[6]。

对于弓形虫病，至今尚无有效的防控手段。因此，开发新的诊断工具，特别是快检技术用于监测疫病的暴发流行就显得非常重要。目前，国内实验动物的弓形虫感染概况在很大程度上是未知的。目前尚未见不同方法检测鉴定实验动物弓形虫的具体研究和感染调查的报道。本研究首次采用酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、聚合酶链反应（polymeras chain reaction，PCR）和直接镜检实时动态显微视屏摄录技术（direct microscopy real-time dynamic video recording technique），对国内实验动物的弓形虫进行快速检定和感染调查，为国家标准的修订提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

2012年12月至2016年12月，12 394只表观健康的实验动物（包括：猴290只、小型猪425只、犬579只、兔1 234只、地鼠372只、豚鼠1 363只、大鼠987只、小鼠7 144只）来自全国60个不同厂家。采血分离血清。

1.2 主要试剂

弓形虫抗体IgG检测试剂盒（酶联免疫法）和弓形虫循环抗原 CAg检测试剂盒（酶联免疫法）购自珠海经济特区海泰生物制药有限公司；DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit）购自德国 Qiagen公司；dNTPMixture、EX Taq、Agarose、DNA Marker购自日本 TaKaRa公司；Nuclease-Free Water购自美国Progema公司。

1.3 主要仪器

THERMO MULTISKAN MK3全自动酶标仪（Thermo ELECTRON CORPORATION，美国）；Verity 96 Thermal Cycler基因扩增仪（Applied Biosystyem，美国）；Gel Logic凝胶成像分析系统（东乐自然基因生命科学公司）；生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，美国）；LEICA DM2500 生物显微镜（Leica M icrosystems，德国）；倒置显微镜及成像系统（Nikon，日本）。

1.4 ELISA检测弓形虫抗体IgG和循环抗原CAg

用ELISA方法检测血清样本中弓形虫抗体IgG和循环抗原CAg。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。每次试验均设阴性对照、临界对照和阳性对照。酶标仪450 nm处测定吸光度 A。抗体 IgG结果判定：样本A450值＜临界对照平均值为阴性，样本A450值≥临界对照平均值为阳性。循环抗原CAg结果判定：样本 A450值＜临界对照平均值 ×0.90为阴性，样本A450值＞临界对照平均值×1.10为阳性。根据试剂盒说明书上判定结果：弓形虫抗体IgG和循环抗原CAg任意一个阳性即定义为弓形虫感染阳性，否则为阴性。计算弓形虫总感染率（弓形虫感染阳性数/总数×100%）。

1.5 引物设计和DNA提取

根据GenBank中公布的弓形虫p30基因序列（major surface parasite antigen）（GenBank登录号：S76248），设计一对 PCR引物（表1）。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。用QIAamp DNA Mini Kit提取待测血清样本 DNA，具体操作见试剂盒说明书。

1.6 PCR扩增和电泳检测弓形虫

PCR总反应体积为50μL，包括：5.0μL 10×Buffer（Mg2+Plus），4.0 μL dNTP Mixture，正、反向引物各 0.5 μL，0.25 μL EX Taq（5 unit/μL），3.0 μL模板 DNA，37.25 μL Nuclease-Free Water。 PCR反应参数：95℃ 1 m in，1个循环；95℃ 30 s，60℃30 s，72 ℃ 1 min，35 cycles；72 ℃ 10 min，1 cycle。试验中阳性对照为弓形虫1型RH株，阴性对照为蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia）、四翼无刺线虫（Aspiculuris tetraptera）、隐匿管状线虫（Syphacia obvelata）、鼠管状线虫（Syphacia muris）。 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。凝胶成像分析系统摄录试验结果。

1.7 直接镜检实时动态显微视屏摄录技术检测弓形虫

在负压生物安全柜内，待测血清用生理盐水进行适当稀释后滴片，采用直接镜检实时动态显微视频摄录技术检测样本中寄生虫病原体。根据虫体的形态和大小来进行虫种的鉴定。

2 结果

2.1 ELISA检测弓形虫抗体IgG和循环抗原CAg结果

用ELISA法对12 394只动物进行了弓形虫检测，每次试验均设阴性对照、临界对照、阳性对照，符合条件者试验结果方有效。结果：循环抗原CAg检出阳性率为0（0/12 394），抗体 IgG检出阳性率为0.03%（4/12 394）。初次检测结果显示，在12 394份血清中检出4份血清弓形虫抗体IgG阳性，第一次检测 A值分别为 2.074、1.954、1.494、1.167；阴性对照值为 0.054；临界值为 0.520、0.519、0.527；阳性对照值为2.596。用同样方法对这4份血清再次检测，第二次检测 A值分别为 1.272、1.075、0.810、0.649；阴性对照值为 0.053；临界值为0.519、0.526、0.516；阳性对照值为 2.453。 这 4 份血清第三次检测 A值分别为1.228、1.460、1.109、1.278；阴性对照值为 0.053；临界值为 0.448、0.445、0.412；阳性对照值为 2.350。根据上述结果，判定这4份血清样本弓形虫抗体IgG阳性。这4份阳性样本均来自于豚鼠（表2）。应用ELISA方法检测实验动物弓形虫，结果从12 394份实验动物样本检出了4份弓形虫阳性样本，弓形虫总感染率为0.03%（4/12 394）。

2.2 PCR检测弓形虫结果

以抽提的样本 DNA为模板，用优化后的 PCR方法检测待测血清样本中的弓形虫 DNA。12 394份实验动物血清样本弓形虫核酸PCR检出阳性样本4份，阳性率0.03%，与弓形虫抗体 IgG检测阳性样本（0.03%）一致。结果如图1显示，这4份弓形虫抗体IgG阳性豚鼠血清中均出现了特异性的目的基因条带，与预期扩增的弓形虫p30基因1 634 bp大小相一致。PCR检测结果说明，这4份弓形虫抗体IgG阳性豚鼠血清中确实存在弓形虫DNA（图 1）。

2.3 直接镜检实时动态显微视屏摄录技术检测弓形虫结果

直接镜检实时动态显微视屏摄录技术检测，在血清样本中发现虫体呈弓形如月牙状，长5～7μm，宽2～4μm，一端较尖，另一端钝圆；一侧扁平，另一侧较膨隆（图2）。依据虫体的大小和形态特征，鉴定为弓形虫速殖子。直接镜检实时动态显微视屏摄录技术检测12 394份实验动物血清样本检出弓形虫虫体阳性样本4份，阳性率0.03%，与弓形虫IgG抗体和p30基因检测结果相吻合（表2）。然而，此类形态学鉴定不足之处为定性检查而非定量检测，该滴片法更不适于虫体计数。因此，对于临床症状不典型的感染动物，应采集血液、精液、腹腔液及靶器官组织，用实时荧光定量PCR进行弓形虫感染的动态分布检测，这在后继感染性试验中精确定量检测弓形虫病原体十分必要。

图1 PCR扩增感染动物血清样本弓形虫p30基因特异性DNA产物琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products am p lified by p rim ers targeted p30 gene specific DNA of genom ic DNA extracted from serum sam p les of anim als in fected w ith Toxop lasm a gondii

图2 中国实验动物中弓形虫速殖子镜检形态Fig.2 M icroscop ic m orphology of Toxoplasma gondii tachyzoite derived from laboratory anim als in China

表2 中国实验动物中弓形虫感染情况Tab le 2 The p revalence of Toxoplasm a gondii in laboratory anim als in China

3 讨论

目前，多数学者认为全世界的刚地弓形虫只有一个种，一个血清型。弓形虫寄生在几乎所有有核细胞中，不仅可经胎盘垂直传播，而且是一种重要的机会致病原虫（opportunistic protozoan）。孕妇感染弓形虫可致流产、早产、死产、胎儿畸形或产出弱智儿，先天性弓形虫病新生儿的典型表现有脑积水、小脑畸形、大脑钙化、脉络膜视网膜炎及精神、运动障碍，还可伴有发热、皮疹、呕吐、腹泻、黄疸、肝脾肿大、贫血、心肌炎、癫痫等。1979年在美国、1997年在加拿大和2006年在巴西分别暴发了急性弓形虫病。弓形虫感染可引起多脏器损害。弓形虫急性播散，常可引起脑膜脑炎、脉络膜视网膜炎、肝炎、肺炎、心肌心包炎、广泛性肌炎、关节炎、肾炎和腹膜炎等。在艾滋病患者中报告的弓形虫脑炎的频率增加，尤其是那些有显著免疫抑制的患者在CD4+T淋巴细胞计数＜200细胞/m L时，而弓形虫感染被认为是导致艾滋病患者死亡的一种重要的机会性病原[7-8]。在抗肿瘤治疗过程中，癌症还可以重新激活潜伏的弓形虫感染[9]。包括淋巴瘤、白血病和骨髓瘤在内的多种恶性肿瘤可以重新激活弓形虫病[10]。从血清阳性供体移植器官可以在接受免疫治疗血清阴性受体中激活潜伏性感染。从血清阴性供体移植器官也能通过激活免疫抑制治疗的血清阳性受体的潜伏性感染来启动致命的感染。将受感染的器官移植到血清阴性受体的危险似乎大于将未受感染的器官移植到血清阳性受体的危险[11]。据报道，在心脏、肝脏、骨髓、造血干细胞移植受体者中出现了致命的弓形虫病[12-15]。家畜感染弓形虫可导致流产、不孕、死胎，不仅对畜牧业造成严重经济损失，还威胁着人类健康。研究表明慢性弓形体病与一些自身免疫性疾病、精神和神经退行性疾病有很大关系。弓形虫感染可以操纵和改变行为。由此可见，弓形虫病具有重要的社会公共卫生意义。

弓形虫感染的检测可采用病原学、血清学、分子生物学等方法。显微镜检查弓形虫病原体特异性强但敏感性低，需要经验丰富的检验人员进行形态学鉴别，工作量大操作繁琐且具有一定的生物安全性危害。血清学方法比较简便快捷便于批量检测，然而，抗核抗体、类风湿因子和同型自然抗体（natural antibody）等，可使血清学方法测定弓形虫抗体时呈现假阳性反应；对于免疫抑制个体或潜伏感染未激发产生抗体的个体则会呈现假阴性结果。因此，对于弓形虫病的诊断需要结合多种方法的检验结果进行综合判断。近年来，将PCR和核酸探针技术应用于弓形虫感染的检测，更具有灵敏、特异、早期诊断的意义，并开始试用于临床[16-17]。Burg等[18]和Homan等[19]报道用PCR方法分别检测弓形虫基因组中35-拷贝B1基因首尾串联（head-to-tail tandem）（GenBank accession number AF179871）194 bp 和300-拷贝 529 bp重复元素序列（repeat element sequence， RE） （GenBank accession number AF146527）。Cassaing等[20]报道用实时荧光定量PCR技术，检测弓形虫B1、RE基因，比较了胎儿、新生儿、免疫低下和眼弓形虫病患者的诊断，结果显示，弓形虫病B1基因分子诊断仅有33.3%的阳性率，而用RE基因对羊水、房水、全血、脑脊液和支气管肺泡液等样品有更高的阳性率。Wang等[21]报道用 MAT（modified agglutination test，改良的凝集试验）检出中国河南地区肉兔血清弓形虫抗体阳性率为3.6%（44/1 213）。Pastorello等[22]报道 HIV病人死亡是由严重播散性弓形体病引起的弥散性坏死性肺炎、脑炎和难治性脓毒性休克的结果。Edvinsson等[23]报道在DNA浓度较低时，应用弓形虫529 bp重复元素实时PCR提高了临床免疫缺陷移植受体血液中弓形虫感染诊断的灵敏度和准确性。Bourdin等[24]报道PCR检测免疫缺陷患者血液样本中弓形虫的敏感性高于免疫能力较强的患者。Burrells等[25]报道分别用ELISA和qPCR对人工感染弓形虫的小牛和小鼠进行了检测，结果发现：经舌、脑和隔膜接种的小鼠具有较高的弓形虫DNA载量，如低Cq值所示；经半腱肌接种的小鼠有较高的DNA载量（由低Cq值表示）和强烈的抗体反应；经腰大肌接种的小鼠也显示低Cq值，但在ELISA中呈阴性；经肝脏、心脏和三头肌接种的小鼠抗体为阴性，具有较高的Cq值，但仍被归类为qPCR阳性；经咬肌和背最长肌接种的小鼠保持了qPCR和ELISA阴性；抗体阳性小牛的咬肌、心脏、隔膜、三头肌、半腱肌中检出了 DNA，肝脏中未检出DNA。因此，研究认为：在实验性感染动物弓形虫传播的检测中，一个单一的测试并不能说明全部的情况。

本研究首先采用ELISA法进行弓形虫抗体（IgG）和循环抗原（CAg）检测，然后再采用 PCR鉴定弓形虫p30基因进行确诊，两者的检测结果一致并由弓形虫速殖子形态学识别确认，发现国内实验动物中确实存在弓形虫感染。此次感染弓形虫的豚鼠均为普通级动物，虽然饲养在相对独立封闭的空间内，但依旧无法排除人、野鼠、猫、犬等传播的弓形虫病，被污染的饲料、饮水、垫料也可能造成该病原体感染的进一步扩散传播。实验动物感染弓形虫后，在正常免疫力的作用下，一般不会出现明显的临床症状，大多数处于隐性感染状态，但在免疫功能下降、处于应激状态或合并感染其他病原微生物时就可能导致严重感染甚至死亡。尽管国内相关实验动物管理部门已采取了一些相对严格的质量监管措施，然而一些厂家自身管理仍存在一定问题。因此，切实加强实验动物监管工作，配备精干高效的抽检队伍，制定严格合理的筛查监测程序，选用快速准确的诊断技术，做好弓形虫病的预防传播工作就显得尤为重要。在今后的研究中，应进一步加大样本采集数量，扩大样本采集范围，为全面掌握我国实验动物弓形虫感染情况和综合防治提供科学依据。